分子篩排阻色譜(凝膠過濾)。它是一種根據生物分子的大小和形狀分離物質的層析方法,凝膠過濾介質是多孔網路結構,當樣品流過填料時,組分之間存在分子量差異,較大的分子首先流出色譜柱,分子量越小, 生物分子進入培養基越深,因此在培養基中的停留時間越長。
1.凝膠過濾色譜的特點
非吸附色譜法,分離度不受實驗條件的影響。
易於使用,只需要乙個緩衝液。
2.博格龍凝膠過濾層析樹脂的種類及其各自特點
(1)Borgron BESTDEX系列:葡聚醣凝膠
Bestdex G系列,常用於蛋白質、多醣、核酸等生物樣品的脫鹽和緩衝液置換,也可用於多肽、寡核苷酸、天然產物、化學藥物的分離純化。
·bestdex lh-20在BestdexG-25F的基礎上用羥丙基改性,引入羥丙基後介質同時具有親水性和親油性,可採用有機溶劑作為流動相,適用於天然產物的分離純化和化學藥物的精細純化。
(2)Borgron bestarose系列:瓊脂糖凝膠
·bestorse 4b/6b由4%和6%瓊脂糖分別經乳化、沖洗、篩分製成的凝膠過濾介質,非特異性吸附性低,基質柔軟,分離範圍廣,適用於分子量差異大、分離度要求低的樣品,適用於多醣等生物大分子的分離、純化或檢測, 核酸和病毒。
·bestorsecl-4b/cl-6b在貝達羅斯4B 6B的基礎上與雙功能交聯劑2,3-二溴丙醇交聯,分離範圍相同,理化效能與貝達羅斯4B 6B相比有明顯改善,適用於有機溶劑的分離,可承受強力原位清洗和121高壓滅菌。
·bestorse ff在貝達羅斯4B 6B凝膠的基礎上與雙功能交聯劑進行交聯,交聯度高於貝達羅斯CL-4B Cl-6B,理化性質更穩定,該類培養基可承受121°C高壓滅菌,流速快,適用於大規模分離純化。
(3)Borglon Chromdex系列:以高交聯瓊脂糖為骨架,交聯葡聚醣為填充物
粒徑為34μm,是解像度和選擇性最高的凝膠過濾樹脂,硬度高,流速快,理化效能穩定,非特異性吸附低,是精細純化階段的良好選擇。
3.凝膠過濾層析填料的應用範圍
(1)分組分離
對於大分子樣品和離子的分離,樣品體積可達柱體積的30%,可用於脫鹽和置換緩衝液。
(2)精細分離
分析純化:樣品的分析純化應達到分析純度,用量小,色譜柱柱高15 30cm,裝樣體積為03%~0.5% 以確保高解像度,同時節省時間和緩衝。
樣品製備:應用於去除不同分子量的聚集體和分離蛋白質,柱高應高於60cm,上樣體積應為0在5%到4%之間。
(3)分子量的測定
通過測定標準蛋白的相對分子量與其在凝膠過濾色譜介質中的保留時間之間的關係來確定未知分子的相對分子量。
由於每種介質的孔徑都有一定的範圍,因此選擇凝膠濾料的關鍵是選擇合適的分離範圍,當分子量在填料的分離間隔內且組分分子量增加一倍以上時,可以保證良好的分離效果。