Sumoylation 是蛋白質的翻譯後修飾和泛素化樣修飾。 它涉及小泛素樣修飾 （SUMO） 與底物上的賴氨酸殘基共價連線。 在哺乳動物中，已經鑑定出三種主要的 SUMO 亞型，包括 SUMO1、SUMO2 和 SUMO3。 與泛素化類似，SUMO 基化由一系列酶催化，包括 E1 SUMO 啟用酶 （SAE1 SAE2）、單個 E2 偶聯酶 （UBC9） 和有限的 E3 SUMO 連線酶。 基於 SUMO 的修飾介導靶分子的定位和功能調控。 目前，sumoylation修飾在細胞生物學中發揮著非常廣泛的作用，也是當前研究的熱點之一。 相生化和去相生化之間的不平衡與多種疾病的發生和發展有關，包括癌症、神經退行性疾病、心臟病和先天免疫疾病。 讓我們來看看文獻：
背景：
Sumoylation調節大量生物過程，其抑制劑目前正在臨床試驗中作為抗癌藥物進行研究。 因此，識別具有位點特異性 sumoylation 的新靶點並確定其生物學功能，不僅將為 sumoylation 訊號轉導提供新的機制見解，還將為開發新的癌症策略開闢道路。 MORC家族的CW鋅指2（MORC2）是一種新發現的染色質重塑酶，在DNA損傷反應（DDR）中發揮新興作用，但其調控機制尚不清楚。
主要方法：
MORC2的SUMO水平通過體內和體外SUMO檢測方法進行測定。 檢測SUMO相關酶的過表達和敲低，以檢測其對MORC2 SUMOLATION的影響。 動態morc2 sumoylation對乳腺癌細胞對化療藥物敏感性的影響。 使用免疫沉澱、GST pull-down、MNASE 和染色質分離測定來探索潛在機制。
主要結果：
Morc2 被 SUMO1 和 SUMO2 修飾 3
為了確定Morc2是否被Sumoylation修飾，作者將Flag-Morc2瞬時轉染到HEK293T細胞中，並在變性條件下使用抗Flag珠進行Sumoylation實驗。 使用抗 SUMO1 或抗 SUMO23 抗體進行免疫印跡分析顯示，SUMO1 和 SUMO23 與 MOR2 偶聯（圖 1A）。 此外，在 MCF-7、T47D 和 HEK293T 細胞中檢測到 SUMO1 和 SUMO2 3 與內源性 MORC2 的結合（圖 1B）。 與Sumoylation抑制劑ML-792孵育導致HEK293T細胞中異位表達的FLAG-MORC2（圖1C）和MCF-7和T47D細胞中內源性MORC2（圖1D）的劑量依賴性降低。 免疫螢光染色顯示，內源性 SUMO1 和 SUMO2 3 與外源性 FLAG-MORC2 共定位在 HEK293T 細胞中，與內源性 MORC2 共定位在 MCF-7 和 T47D 細胞中（圖 1E-F）。 這些結果表明，在哺乳動物細胞中，所有三種SUMO亞型都與Morc2共價結合。
由於 UBC9 是 Sumoylation 所需的唯一 E2 偶聯酶，因此作者隨後通過免疫沉澱 （IP） 實驗研究了 MORC2 是否與 UBC9 相互作用。 如圖 1G 所示，當 HA-UBC9 和 FLAG-MORC2 在 HEK293T 細胞中共表達時，HA-UBC9 對 Flag-MORC2 進行免疫沉澱。 在HEK293T細胞中檢測到內源性蛋白質水平上的Morc2和UBC9之間的相互作用（圖1H-I）。 在HA-UBC9存在下，所有三種SUMO亞型（GFP標記的SUMO1，SUMO2和SUMO3）都與MORC2結合（圖1J）。 HA-UBC9 的異位表達增強，而 CRISPR Cas9 技術敲除內源性 UBC9 降低了 MCF-7 細胞中內源性 MORC2 的 sumoylation（圖 1K-L）。 綜上所述，這些結果表明Morc2是一種sumoylized蛋白。
賴氨酸 767 （K767） 是 Morc2 中的主要 sumoylation 位點
為了確定 MORC2 的潛在 SUMOYLATION 位點，作者使用 GPS（基於組的預測系統）-SUMO 和 JASSA （SUMOYLATION 位點和 SIMS 聯合分析儀）程式來 ** MORC2 的 SUMOYLATION 位點。 將 Morc2 中潛在的 sumoylation 位點縮小到賴氨酸 767 （K767） 和 K827。 為了驗證 Morc2 在這兩個位點被 SUMO 化，作者分別將 K767 和 K827 突變為非 SUMO 殘基精氨酸 （R），然後將野生型 （WT）、K767R 或 K827R 突變體 Flag-Morc2 與 GFP-SUMO1、GFP-SUMO2 或 GFP-SUMO3 分別轉染到 HEK293T 細胞中。 與WT對應的突變體相比，使用所顯示抗體的Sumoylation分析顯示，與WT對應的突變體相比，表達K767R的細胞中SUMO1和SUMO2 3的修飾減少，而K827R的突變體Morc2沒有減少（圖2A-C）。 此外，與 WT MORC2 相比，內源性 SUMO1 和 SUMO2 3 與 K767R 突變體 Flag-MORC2 的結合減少（圖 2D）。 這些結果表明，K767是Morc2的主要SUMO位點。
在 Morc2 的 n 側有乙個功能性 sim 對於其有效的 sumoylation 是必要的
SIM卡是某些SUMO基板的有效總結所必需的。 使用 GPS-SUMO 和 JASSA 程式對 Morc2 蛋白序列的分析顯示，MORC2 中存在兩個假定的 SIM，分別位於殘基 144-148 和 413-417 中，分別稱為 SIM1 和 SIM2。 為了評估這兩種SIM在Morc2 Sumoylation中的功能重要性，作者通過用丙氨酸代替疏水殘基（此處分別稱為SIM1mut和SIM2mut）來突變兩個SIM序列。 Sumoylation 實驗表明，flag-Morc2 Sim1mut 而不是 Sim2mut 降低了 Morc2 Sumoylation（圖 2E-F）。
Trim28 作為 SUMO E3 連線酶參與 MORC2 SUMO 修飾。
BioGrid 分析是乙個蛋白質相互作用資料庫，確定了兩種假定的 SUMO E3 連線酶，即 TRIM28 和 ChromoBox 4 （CBX4）。 儘管 Flag-Morc2 與 HEK293T 細胞中的內源性 CBX4 相關，但 FLAG-CBX4 的異位表達對 Flag-Morc2 的 Sumoylation 沒有顯著影響，表明 CBX4 不是 Morc2 Sumoylation 的 Sumo E3 連線酶。
接下來，作者研究了 TRIM28 是否誘導 Morc2 sumoylation。 IP和蛋白質印跡實驗表明，Flag-Morc2與HA-trim28在HEK293T細胞中共免疫沉澱（圖3A）。 免疫螢光染色顯示，在MCF-7細胞的細胞核中也觀察到FLAG-MORC2和HA-TRIM28的共定位（圖3B）。 此外，在 MCF-7 細胞中檢測到內源性 MORC2 和內源性 TRIM28 之間的關聯（圖 3C-D）。
為了繪製 Morc2 與 TRIM28 相互作用所需的結構域，作者在 HEK293T 細胞中生成了三個 MORC2 缺失和截短結構，並進行了 Co-IP 測定。 如圖 3E-F 所示，MORC2 的 N 末端包含乙個保守的 ATP 酶結構域，該結構域是其與 TRIM28 相互作用所必需的。 同樣，Morc2在其N末端缺少殘基1-420，無法與TRIM28結合（圖3G-H）。 這些結果表明，MORC2 的 N 端 atp 酶結構域對其與 TRIM28 的相互作用至關重要。
為了確定 MORC2 SUMOYLATION 是否需要 TRIM28，作者研究了 HA-TRIM28 的異位表達和 MORC2 SUMOYLATION 水平的檢測。 如圖 3i 所示，異位 TRIM28 顯著增強了 WT 的 sumoylation，但對 K767R 突變體 Morc2 沒有影響。 此外，TRIM28的過表達對Morc2蛋白水平沒有顯著影響。 此外，只有WT TRIM28的過表達，而不是其催化失活的C651A突變體，才能有效增強Morc2的sumoylation（圖3J）。 相比之下，兩個獨立的shRNA敲低TRIM28顯著降低了HEK293T細胞中異位表達的Flag-Morc2（圖3K）和MCF-7細胞中內源性Morc2的sumoy化（圖3L）。 這些結果表明，trim28 是 Morc2 Sumoylation 所需的相撲 E3 連線酶。
Senp1 是一種 Morc2 解溶酶
由於Morc2被所有三種SUMO亞型修飾（圖1），作者接下來研究了Senp1-3在MORC2的去SUMOlation中的潛在作用。 為此，將 FLAG-MORC2、HA-UBC9 和 GFP-SUMO 轉染到 HEK293T 細胞中。 結果表明，在與Senp1和Senp2共轉染後，Morc2的sumoylation減弱，而Senp3沒有減弱（圖4A）。 免疫螢光染色顯示，HA-SENP1與FLAG-MORC2在細胞核中共定位，而HA-SENP2和HA-SENP3不共定位（圖4B）。
為了確定 senp1 是否介導 Morc2 去化，作者檢查了 senp1 和 morc2 之間的相互作用。 IP分析表明，Senp1與Morc2相互作用（圖4C）。 在MCF-7細胞中觀察到senp1和morc2在內源性蛋白質水平上的相互作用（圖4D）。 此外，SENP1過表達顯著降低了HEK293T細胞中異位表達的Morc2和MCF-7細胞中內源性Morc2的sumoy化（圖4E-F）。 WT Senp1 的異位表達，而不是其催化失活的 C603S 突變體，有效地消除了 Morc2 的蘇莫醯化（圖 4G）。 類似地，Senp1的缺失顯著誘導HEK293T（圖4H）和MCF-7細胞（圖4I）中的Morc2 sumoylation。
DNA損傷後，Morc2sumoylation降低
由於Sumoylation與DNA損傷反應（DDR）有關，因此作者接下來測量了DNA損傷劑是否會影響MORC2的Sumoylation。 用ADR（阿黴素）處理HEK293T細胞2小時後，Morc2Sumoylation以劑量依賴性方式降低。
HEK293T細胞回收後，ADR誘導的Morc2 Sumoylation的快速丟失得以恢復（圖5A-B）。 這些結果表明，MORC2 Sumoylation 對 DNA 損傷的反應是高度動態的。 為了研究Morc2 Sumoylation響應DNA損傷的動態變化的潛在機制，作者測試了ADR是否影響Morc2與TRIM28或SENP1的相互作用。 如圖5C所示，用ADR處理2小時後，TRIM28或SENP1的蛋白水平沒有顯著變化，但MORC2與TRIM28的相互作用顯著降低，而Senp1則沒有。 有趣的是，Morc2 和 TRIM28 之間受損的相互作用在指定的恢復時間後恢復（圖 5C），而 Morc2 和 Senp1 之間的關聯略有下降。 敲除 TRIM28 顯著損害了 ADR 處理後 Morc2 Sumoylation 的回收率（圖 5D）。 這些資料表明，精確調控的 MORC2 Sumoylation 主要依賴於 TRIM28 對 DNA 損傷的反應。
先前的研究表明，MORC2 在響應 DNA 損傷時發揮 ATP 酶依賴性染色質重塑活性。 接下來，作者確定了早期MDR Morc2去化是否與其染色質重塑活性有關。 用 ADR 處理表達 WT MORC2 的細胞可增強染色質對 MNase 的可及性。 此外，這種作用在表達Sumoylation缺陷的Morc2（K767R或SIM1mut）的細胞中得到增強（圖5E-F）。 作者應用染色質分離測定來鑑定染色質的不同性質。 抗核酸酶染色質成分富含組蛋白 3 賴氨酸 9 三甲基化 （H3K9Me3），這是異染色質形成的標誌，表明染色質核小體高度濃縮。 如圖 5G-H 所示，ADR 處理將富含 H3K9Me3 的核小體從 C5 部分轉移到對核酸酶更敏感的 C4 部分。 這一發現證實了人們普遍持有的觀點，即受損的染色質相對更容易獲得。 然後，作者測試了morc2 sumoylation是否參與了這一過程。 研究結果與圖5g所示結果一致。 不良反應**後，WT Morc2 的表達降低了 C5 部分中富含 H3K9Me3 的核小體染色質。 此外，Sumoylation缺陷的Morc2突變體增強了這種效果（圖5i-j）。 因此，遺傳毒性損傷後依賴於 Morc2 染色質重塑活性的染色質可及性增加通過去氨醯化增強，這進一步促進了 DNA 修復。
Morc2 Sumoylation 有助於 DNA 修復
完整的 Morc2 sumoylation 迴圈對於遺傳毒性應激反應中的細胞存活至關重要。 據報道，共軛SUMO分子在各種生物過程中對底物產生廣泛的影響，改變底物相互作用並調節其功能。 然後，作者研究了Morc2 Sumoylation是否改變了其相互作用並在功能上有助於DNA修復。 作者使用Co-IP分析結合LC-MS MS鑑定了Sumoylated Morc2相互作用基團。 蛋白激酶CSK21、CHD4和XRCC5的功能與DNA修復密切相關。 為了驗證這些結果，作者進行了 IP 分析，發現 Morc2 Sumoylation 顯著增加了 Morc2 與 CSK21 和 CHD4 的相互作用，而 Sumoylation 缺陷的 Morc2 突變體即使在存在 Sumo 過表達的情況下也極大地破壞了這些相互作用（圖 6A）。 用Sumoylation抑制劑ML-792 20處理MCF-7和T47D細胞可減少Morc2的Sumoylization，從而顯著減少Morc2與CSK21和CHD4的相互作用（圖6B）。 接下來，作者測試了 ADR 處理後 MORC2 Sumoylation 的恢復是否可以增加 Sumo-MORC2 與 CSK21 和 CHD4 結合的親和力，從而增強 DNA 修復。
作者首先測試了CSK21是否是Morc2 Sumoylation結合效應。 ADR釋放後，MORC2與CSK21相互作用的衰減恢復（圖6C），但ML-792處理顯著損害了結合回收率（圖6C）。 因此，Morc2 Sumoylation的缺失會減少CSK21的募集，可能不利於下游因子的進一步啟用。 作者用 ADR 處理 WT 和 K767R 突變的 Morc2 細胞 2 h，並在指定時間內釋放它們，並觀察到 DNA-PKC 的啟用。 圖6D-E顯示，與K767R突變體相比，WT MORC2顯著增加絲氨酸2056的DNA-PKCs磷酸化，但不影響其總蛋白水平。 免疫螢光染色證實了這一結果（圖6F-G）。 上述資料表明，Morc2 Sumoylation 可能部分通過 CSK21 誘導的 DNA-PKC 啟用來促進有效的 DNA 修復。
Morc2 Sumoylation 是細胞在 DNA 損傷劑作用下存活所必需的
接下來，作者研究了Sumoylation是否介導了Morc2在DNA修復過程中的生物學功能，從而影響了遺傳毒性應激下的細胞存活。 為了消除內源性Morc2的潛在影響，作者敲除了MCF-7和T47D細胞中的內源性Morc2，然後用重組WT，Sumoylation缺陷突變體K767R和慢病毒感染Sim1mut Morc2（圖7A）。 用DNA損傷劑ADR處理細胞30 min後恢復24 h，免疫螢光染色檢測Ser139上磷酸化組蛋白H2ax（H2AX）水平。 DNA 損傷後 H2AX 的長期存在表明 DNA 修復存在缺陷。 如圖7B-C所示，在恢復24小時後，表達K767R和Sim1mut突變體Morc2的細胞比表達WT Morc2的細胞具有更高水平的H2ax病灶，這表明Sumoylation缺陷突變體導致DNA損傷的清除效率低下。 菌落形成實驗表明，WT MORC2降低了細胞對ADR（圖7D-E）和另一種DNA損傷劑MMS（圖S10A-B）的敏感性，而K767R或SIM1mut突變體則沒有。 CCK-8 測定表明，Morc2 的蘇莫醯化對細胞對 ADR 的敏感性具有相似的影響（圖 7F）。 這些資料表明，在遺傳毒性應激反應中，morc2 sumoylation 是細胞存活所必需的。
為了驗證MORC2 Sumoylation是否在乳腺癌細胞對ADR的耐藥性中起重要作用，作者建立了人LM2-4175細胞的異種移植腫瘤模型。 將Morc2缺失的LM2-4175細胞皮下注射到具有穩定重組WT或K767R MORC2的裸鼠中。 小鼠腹膜內注射3mg kg ADR以監測異種移植物的腫瘤生長。 如圖7G-H所示，表達K767R突變體MORC2的腫瘤在ADR治療後比表達WT MORC2的腫瘤更小、重量更輕，表明MORC2 K767R突變細胞對ADR更敏感。
綜上所述，本研究結果表明，在K767位點，Morc2被SUMO1和SUMO2 3修飾，並且該事件受到SUMO E3連線酶TRIM28和SENP1的精確調控。 此外，動態調控的 Sumoylated Morc2 對於染色質重塑和 DNA 損傷的 DNA 修復至關重要，並驅動乳腺癌的化療耐藥性。 因此，用 SUMO 抑制劑干擾 MORC2 的 SUMO 是逆轉 MORC2 驅動的化療耐藥性的潛在策略。
蛋白質翻譯