細胞增殖、凋亡和細胞週期是腫瘤研究中的重要表型,也是分子生物學和藥理學研究中要解決的問題之一。 通過過表達或干擾細胞中的基因來研究基因對細胞增殖的影響,進一步研究基因的功能,或用藥物處理細胞以研究藥物對增殖的影響。
1.MTT方法:是一種檢測細胞存活和生長的方法。 該方法已廣泛應用於生物活性因子的活性檢測、抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性測定等。 它的特點是靈敏度高、經濟、速度快。
原理:活細胞線粒體內的琥珀酸脫氫酶能將外源性MTT還原為不溶於水的藍紫色結晶甲臢並沉積在細胞內,而死細胞則不具備此功能。 二甲基亞碸(DMSO)能裂解細胞中的甲臢,其吸光度值在490nm波長處通過酶聯免疫測定法測量,可間接反映活細胞數量。 在一定的細胞計數範圍內,MTT結晶量與細胞數成正比。
2.CCK-8方法:可用於簡單準確的細胞增殖和毒性分析,常用於藥物篩選、細胞增殖試驗、細胞毒性試驗、腫瘤藥敏試驗等。
原理:試劑中含有WST-8[化學名稱:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽],在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪二甲基硫酸鹽(1-甲氧基PMS)的作用下,在細胞內被脫氫酶還原為高度水溶性黃色甲瓚染料(甲瓚染料)。 產生的甲臢量與活細胞的數量成正比。 因此,該特性可用於直接細胞增殖和毒性分析。
3. brdu:即 5-溴-2'-脫氧尿苷,中文全稱5-溴脫氧尿嘧啶核苷,是胸腺嘧啶的衍生物,可在DNA合成階段、S期體內注射或細胞培養中代替胸腺嘧啶新增。 隨後,用抗BRDU單轉殖抗體進行ICC染色顯示增殖細胞。 同時,其他細胞標誌物的雙重染色可用於確定增殖細胞的型別和速率,這對細胞動力學的研究具有重要意義。
然而,由於抗體分子量較大,難以摻入和有效檢測。 因此,BRDU檢測需要使用DNase或HCl或加熱進行DNA變性。 這些處理會破壞抗原識別位點,並且細胞週期分析需要許多染料的dsDNA。 這種處理方式也無法同時對同一樣品進行細胞週期分析。 用於分析植物細胞和其他具有細胞壁的細胞。 抗體檢測還需要消化細胞壁,細胞壁通常含有會降低檢測可靠性的雜質,而BRDU檢測需要長達數小時甚至過夜的孵育期。
4. edu:5-乙炔基-2'-脫氧尿苷是一種胸腺嘧啶核苷類似物,可在細胞增殖過程中取代胸腺嘧啶 (T) 浸潤複製的 DNA 分子。 適用於細胞增殖、細胞分化、生長發育、DNA修復、病毒複製、細胞標誌物示蹤等研究,尤其適用於siRNA、miRNA、小分子化合物等藥物的篩選實驗。