本文重點介紹利用微生理系統研究脂肪肝及其對藥物性肝損傷的影響。
來自製藥公司阿斯利康的研究團隊利用CN Bio Physiomimix構建了脂肪肝模型，研究了脂肪肝模型中各種代謝酶活性的差異以及多種肝毒性風險較強的藥物對脂肪肝疾病的損害效能（各指標的變化）。
由於糖尿病、肥胖症和代謝症候群的患病率增加，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）現在是發達國家常見的慢性肝病（1）。 NAFLD的病理範圍從良性肝脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎（NASH），可導致肝硬化和肝癌。 目前尚無FDA批准的NAFLD NASH藥物，顯然需要更好的模型來了解這種疾病。
此外，人們越來越意識到由於內在代謝狀況導致的藥物性肝損傷 （DILI） 的潛在危險因素。 NAFLD患者的DILI可能以兩種不同的方式惡化：一些藥物似乎會加劇先前存在的NAFLD，導致細胞內脂質積累過多，而另一些藥物則更頻繁地誘發急性肝炎和肝損傷（2）。 有人提出，肥胖患藥物性急性肝炎的風險更高，並且與幾種細胞色素 P450 （CYP） 物種的活性增加有關，從而增強有毒代謝物的產生 （2）。 當過量產生時，反應性代謝物可引起肝臟氧化應激、嚴重的線粒體功能障礙和細胞溶解。
然而，這些過程發生的機制知之甚少，並且由於肥胖症的流行，脂肪肝引起的藥物不良反應變得越來越普遍。 因此，我們開發了一種先進的體外模型來探索DILI和NAFLD的關係和機制。
CN-Bio Microphysiological Systems （MPS） 開發了一種完整的人類體外灌注 NAFLD 模型，該模型利用 3D 培養的原代人肝細胞 （PHH） 來模擬肝臟的微觀結構。 用高濃度的游離脂肪酸培養細胞長達四周，以誘導細胞內甘油三酯（脂肪）積累並模擬肝臟脂肪變性。 研究了該模型中細胞中CYP酶活性的變化以及已知肝毒性藥物在IC：50濃度附近給藥時的影響。
來自賽默飛世爾（美國）的原代人肝細胞 （PHH） 的冷凍儲存可播種板。 將 0將 6 x 106 的肝細胞接種到 Physiomimix OOC LC-12 板 （CN Bio Innovations Ltd） 的每個孔中，並在含有生理相關葡萄糖、胰島素和高濃度飽和不飽和游離脂肪酸的 HEP-Lean 或 HEP-FAT 培養基中培養。 細胞在 Physiomimix 平台上培養長達 18 天（圖 1）。
A） 體外模型利用 PhysioMimix OOC 細胞培養系統，該系統使用開孔板設計，用於在工程支架中以 3D 方式培養原代肝細胞。b） LC-12肝晶元板上單個培養孔的示意圖。c） LC-12多孔板示意圖。d） 在整個實驗過程中，用固定在板上每個孔中的支架連續灌注細胞培養基，以提供生物力學刺激和氧氣** （3）。E） 通過在高脂肪培養基中培養 PHH 長達 28 天來生成 NAFLD 模型。為了研究迪力，僅在脂肪負荷 14 天後給予復合劑量。
通過固定微組織的油紅O染色測量脂肪堆積，並在Nikon Eclipse Ti-E倒置螢光顯微鏡上獲取影象（圖2）。 通過515nm處的吸光度對染色進行定量，並歸一化為通過BCA測定（ThermoFisher）測定的總蛋白質含量。 通過ELISA（RD系統）測量白蛋白的產生，使用Cyto-Tox96測定（Promega）定量LDH釋放，並使用細胞滴度GLO測定（Promega）評估細胞活力。
圖2 人原代肝細胞中細胞內脂肪隨時間推移的積累。 在高脂肪培養基中培養的基因表達譜發生改變。
PHH在高脂和無脂條件下培養14天。 通過微組織的油紅O染色測量脂肪負荷，並使用Liver RT2 Profiler PCR陣列比較基因表達。 A） 對細胞內脂肪積累進行成像，b） 通過 510 nm 處的吸光度定量並歸一化為總蛋白質含量。c） 通過 ELISA 量化白蛋白的產生，以及低脂和高脂肪培養物之間的基因表達變化 d） 通過倍數變化 18 和 p 005 劃定標準。 e） 高脂肪與低脂肪條件下關鍵基因表達的倍數變化。資料是來自 9 個獨立培養物的平均 SEM（每個病例 3 個供體，每個供體 n = 3 個樣本）; *p ＜0.05。資料取自 Kostrzewski 等人之前發表的 2017 年 （3）。
對於轉錄組分析，使用Trizol從支架中提取總RNA。 使用RT2分析儀陣列（QIAGEN）生成並比較cDNA樣本，該陣列對脂肪肝相關基因具有特異性。使用兩種方法評估 CYP 活性; 使用CYP3A-GLO實驗（Promega）或LC-MS對特定化合物濃度進行定量。 簡而言之，細胞暴露於一系列對不同 CYP-450 酶具有特異性的化合物。 使用以下化合物：非那西丁（CYP1A2）、雙氯芬酸（CYP2C9）、S-甲基苯妥英（CYP2C19）、丁呋洛爾（CYP2D6）、Mida**（CYP3A4）和氯唑酮（CYP2E1）。 每種化合物將以 1 M 的起始濃度施用 48 小時，使用 01 DMSO 作為溶劑。 使用LC-MS定量細胞培養基樣品中每種化合物的I期代謝物的產量。
圖 3 – PHH 在高脂條件下培養 14 天，然後新增探針化合物以評估關鍵 CYP-450 酶的代謝活性。
通過在48小時內產生I期代謝物來確定每種酶的活性。 使用LC-MS和代謝物標準曲線定量代謝物的存在。 所有化合物均在第 14 天給藥，但 CLZX（CYP2E1 靶標）除外，該化合物在第 7 天給藥。 每個資料至少為 n = 3。 * = p <0.05。
圖 4 – 在低脂培養基條件下，在膠原包被的 96 孔板上培養 PHH 72 小時。
將細胞暴露於不同濃度的a）對乙醯氨基酚，b）甲氨蝶呤和c）噻氯匹定48小時，然後使用Cell Titre GLO評估細胞活力。d） 為每種化合物生成 IC：50 值，並將其與已發表的資料進行比較 （4）。顯示的資料是 MEAN SD，最多。 小是 n = 4。
圖 5 – 將 PHH 在高脂質條件下孵育 14 天，然後在先前測定的 IC：50 濃度附近加入化合物。
將每種化合物以單次48小時或兩次48小時（多次）劑量施用到PHH微組織中。 施用的每種化合物稀釋在含有01 DMSO 溶劑在低脂培養基中。 對照低脂和高脂微組織僅用溶劑給藥。 通過測量細胞培養基中的LDH釋放，細胞培養基中的白蛋白產生以及確定施用不同化合物後肝細胞中的CYP3A4活性來評估細胞健康。 資料為平均SD，n = 4。 * = p <0.05。
使用MPS平台PhysioMimix，我們生成了NAFLD的人體體外模型。 PHH 在含脂肪培養基中培養，該培養基在臨床疾病的早期階段誘導關鍵特徵，包括細胞內脂肪負荷、白蛋白生成增加以及關鍵基因（包括參與代謝和胰島素抵抗的基因）表達的變化。 我們進一步研究了脂肪負荷後PHH的代謝活性，以確定細胞內脂質積累如何調節CYPase的活性。 模擬體內（臨床）觀察 （2），我們看到各種酶的增加，包括：CYP1A2、CYP2C9 （1.）5 倍）、CYP2C19（2 倍）和 CYP2E1（2 倍）。5倍）活動。此外，我們觀察到脂肪負荷後 CYP3A4 活性略有下降。 通過在體外NAFLD模型中評估對乙醯氨基酚、噻氯匹定和甲氨蝶呤的毒性，研究了這些代謝變化對肝細胞對DILI敏感性的影響。
對乙醯氨基酚和噻氯匹定在脂肪負載細胞中引起更過度的DILI反應，導致LDH釋放增加，白蛋白產生減少和CYP3A4活性降低（作為細胞活力的衡量標準）。 當化合物多次施用到肝組織時，這些變化通常更為明顯。 顯示。 在存在脂肪負載肝細胞的情況下，甲氨蝶呤給藥似乎不會引起 DILI。 總之，這些資料展示了MPS平台和相關的NAFLD模型如何在早期階段捕獲關鍵特徵，並展示了一系列臨床觀察到的對DILI的反應。
該方法將成為分析新化合物的毒性特徵以及它們在不同患者亞群中的行為（引出 DILI）的有用工具。
1.friedman sl, neuschwander-tetri ba, rinella m, et al. nat med 2018;24:908-922.
2.fromenty b. drug-induced liver injury in obesity. j hepatol 2013;58:824-6.
3.kostrzewski t, cornforth t, snow sa, et al. world journal of gastroenterology 2017;23:204-215.
4.proctor wr, foster aj, vogt j, et al. arch toxicol 2017;91:2849-2863.
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