近年來，抗體在各種疾病的新**研究中顯示出巨大的潛力。 在癌症**領域，對抗體-藥物偶聯物 （ADC） 的研究正在蓬勃發展。 ADC利用單轉殖抗體（mAb）的特異性，以靶向方式將細胞毒性藥物遞送至表達特定標誌物或抗原的腫瘤細胞，從而實現靶細胞的死亡。 乳腺癌藥物Kadcyla是一種ADC藥物，由靶向HER2的曲妥珠單抗（赫賽汀）與細胞毒性藥物異美他嗪（DM1）聯合組成。
其作用機制（MOA）如下： DM1定向轉運至HER2陽性細胞 曲妥珠單抗介導的HER2訊號通路抑制 抑制HER2細胞外結構域從細胞膜脫落 抗體介導的ADCC。
在乳腺癌藥物KADCYLA的主要作用機制中，抗體有效地與細胞表面的HER2結合並指導藥物的內化，導致DM1分子的細胞內釋放。 因此，ADC藥物的結合、內化和毒性的實驗研究是必不可少的。 這些過程的動態可以通過Incucyte實時活細胞分析系統進行捕獲和分析。
Incucyte實時活細胞分析系統。
Kadcyla結構示意圖。
1.抗體內化。
方法：Incucyte Human FabFluor-pH Antibody Labeling DYE 一步法特異性標記人 IgG 的 Fc 片段，對 pH 敏感，可達到以下效果：標記的抗體複合物一旦與特定位點結合，就會被細胞內化並進入低 pH 溶酶體環境。 隨著pH值的變化，染料會產生螢光訊號，當使用Incucyte活細胞分析系統時，可以視覺化抗體的內化。
在新增標記抗體藥物後 12 小時，Kadcyla 和曲妥珠單抗在 HER2 陽性乳腺癌細胞 AU565 中顯示出更高水平的內化（與 IgG 陰性對照組和 HER2 表達低的 MDA-MB-231 細胞組相比）。 6 g ml Kadcyla組在<6 h時達到平台期。 Kadcyla和曲妥珠單抗的24小時EC50值分別為0%38 μg/ml，0.22 g ml，表現出相似的結合特異性和內化作用。 這些觀察是通過使用活細胞分析系統和活細胞成像儀進行的。
2.細胞增殖。
方法：Incucyte Nuclight Green Lentivirus試劑在AU565細胞中穩定表達綠色核螢光訊號。 賽多利斯的 Incucyte 活細胞分析系統可實時捕獲影象並分析細胞核數量，以表徵細胞增殖狀態。
Kadcyla 中的 DM1 是一種微管蛋白抑制劑，可抑制微管的組裝，導致細胞週期中斷，從而導致有粒體**停止，然後死亡。 當 Kadcyla 被內化為溶酶體時，DM1 被切割並釋放到細胞中，並在細胞中發揮作用。
藥物作用 72 小時後，kadcyla （15 g mL）顯示不健康的細胞形態，增殖受到顯著抑制（與IgG陰性對照組和曲妥珠單抗組相比）。Kadcyla對細胞增殖的抑制作用的IC50為024 g ml，與內化滴度相似，並顯示出與喜樹鹼相當的最大細胞殺傷力。 使用細胞健康指示劑 incucyte 膜聯蛋白 v 染料 （030 g ml，資料未顯示）測定Kadcyla細胞凋亡滴度一致。
3.細胞週期。
方法：Inucyte Cell Cycle Lentivirus Agent在Au565細胞中穩定表達G1和S G2 M期螢光指示劑，且該試劑不影響細胞的正常功能。 細胞核在 S g2 m 相處發出綠色螢光; 細胞核在 M 至 G1 相中是無色的; 細胞核在 G1 期發出紅色螢光; 在 G1 至 S 期，細胞核發出黃色螢光（綠色與紅色疊加）。 Incucyte 活細胞分析系統實時捕獲影象，Incucyte Cell-by-Cell Module分析不同顏色的細胞核數量，以表徵細胞週期狀態。
在正常情況下，AU565細胞週期不同階段的細胞百分比為綠色（S g2 m，40 3%），紅色（G1,24 2%），黃色（G1 S，15 2%）或無色（M g1,20 4%）。 在Kadcyla（3g ML）處理的AU565細胞的前24小時內，紅細胞減少（下降至13%），無色細胞增加（高達27%），表明M G1期迴圈停止。 在36小時時，影象主要顯示綠色細胞（24%）和非螢光細胞（52%），這些細胞及其越來越圓的形態表明週期停滯發生在有絲分裂階段附近。 48小時後，細胞在形態上似乎不健康，正在死亡。 同種型比較劑IgG或曲妥珠單抗（資料未顯示）影響不大。
4、adcc
方法：將穩定表達綠色核螢光訊號的AU565靶細胞與NK細胞按5：1的功效比培養，不同濃度的Kadcyla加入不同樣品組。 將 Incucyte 膜聯蛋白 v nir 染料新增到培養基中以表徵細胞凋亡訊號。 Incucyte 活細胞分析系統實時捕獲影象以分析靶細胞數量和細胞凋亡訊號，以表徵 ADCC 效應。 為了證明KADCYLA的綜合功效，將其通過常規ADCC殺死靶細胞的能力（與直接殺傷相結合）與其在單次培養中的直接細胞毒性作用（單一培養）進行了比較。
在單一培養和共培養孔中，綠色螢光均存在與濃度相關的降低，表明 Kadcyla 處理的靶細胞死亡。 從影象中可以明顯看出，在NK存在的情況下，額外的ADCC作用比單獨的直接細胞毒性作用更強。 ADCC殺死靶細胞的速度更快，強度約為25倍（EC50：直接細胞毒性0.）。27 g ml，ADCC 為 0011 μg/ml）。膜聯蛋白V訊號顯示出類似的資料。 96 h資料顯示，ADCC共培養模型提高了靶細胞清除率，這與Kadcyla對腫瘤細胞清除率的高臨床療效一致。
綜上所述，Incucyte活細胞分析系統是使用KADCyla作為ADC藥物的乙個例子，它可以簡單明瞭地視覺化和定量KADCYLA的抗體內化、細胞增殖、細胞週期和ADCC效應。
Kadcyla 與表達 HER2 的細胞特異性結合，並以與曲妥珠單抗相似的效率和效力內化。
與曲妥珠單抗不同，Kadcyla一旦內化，就會通過釋放細胞毒性負荷DM1（一種有效的微管蛋白抑制劑）導致細胞定向死亡。
Kadcyla介導的ADCC活性和直接殺傷的聯合作用提高了腫瘤細胞清除的效率。
為什麼選擇Incucyte實時活細胞分析系統？
選擇Incucyte實時活細胞分析系統的原因歸結為其多種優勢：
該系統允許在培養箱內連續觀察數週，拍攝間隔短至幾分鐘，大大減少了手動操作的需要，並防止過度干預可能對細胞造成傷害。 這保證了關鍵資訊的捕獲，例如文章中提到的細胞週期動力學的監測，從而可以目視觀察細胞阻滯。
Incucyte 配備 6 個位置，每個位置都可以獨立程式設計，並且與各種板和培養皿相容，用於高通量實驗。 無論是免疫抑制劑、療效靶標比等多種實驗組合，Incucyte都能一次性完成所有實驗組的檢測。