背景：
自2013年獲得諾貝爾獎以來，外泌體一直是國際科學界的研究熱點。 近十年來，它的受歡迎程度一直居高不下，如今依然穩居全國自然熱點排行榜第五位！ 讓我們繼續揭開這個細胞外囊泡的神秘面紗吧！
外泌體個人名片：
名字：外泌體 ;
物種：細胞外囊泡;
大，小：直徑30-150nm;
密度：1.1-1.18g/ml；
形狀： “碟形”;
源：：由所有活細胞分泌;
存在：存在於幾乎所有組織、細胞間隙、體液中;
數量：在人體內大約有1014個，平均每個細胞差不多有1000-10000個;
功能：調節細胞代謝、控制炎症、促進血管生成、促進組織修復、免疫調節、癌症發生發展、抗原呈遞等
榮譽：2013年諾貝爾生理學或醫學獎獲得者。
攜帶物質：脂質、蛋白質、DNA 和 RNA（miRNA、LNCRNA、環狀 RNA、mRNA）;
突出特點：異質性，即同一細胞分泌的外泌體可能具有很大的功能差異;
圖 外泌體結構及特點。
外泌體的性質及相關應用：
1.異質性，可作為疾病診斷的生物標誌物
不同細胞分泌的外泌體在數量、細胞膜和內容物組成、生物學功能等方面存在差異，且具有異質性。 外泌體的大小和含量可以反映分泌細胞的型別和狀態，並能準確調節體內的各種生理活動，可作為疾病診斷的生物標誌物。 通過分離和純化體液中的外泌體，分析其中所含的特徵性mirNAs或蛋白質，然後將其與疾病特徵標誌物進行比較，可以確定疾病的型別。
存在，可用於免疫調節
外泌體通常通過遞送多種生物分子來完成抗原呈遞、免疫啟用抑制和免疫耐受的過程。 其中，抗原呈遞細胞分泌的外泌體可以攜帶和呈遞相關複合物，通過減弱或增強免疫反應來達到免疫的目的。 此外，外泌體負載著許多免疫相關分子，包括溶酶體相關膜蛋白 1 和 2、免疫球蛋白超家族成員 8 和 MHC，它們可以特異性結合相關肽鏈並誘導免疫反應。
3.去免疫，可作為藥物遞送載體
外泌體的特點是免疫原性低，可以逃避大多數免疫系統的識別和攻擊。 與傳統化學藥物的生物相容性差、易被人體清除、溶解性和通透性差等缺點相比，外泌體具有奈米級體積、細胞毒性低、生物膜通透性和生物相容性好等諸多優點，其脂質雙層膜結構可以保護內容物不被降解，保持生物活性。 因此，外泌體可以作為載體遞送藥物，幫助藥物逃避免疫系統，跨越組織屏障，提高藥物遞送和吸收的效率。
4.致瘤性強，可應用於腫瘤**
腫瘤細胞**外泌體的致瘤原促進性質表現為調節機體免疫功能，同時也向受體細胞傳遞有害資訊，導致細胞病變; 此外，腫瘤細胞會分泌外泌體，將部分藥物排出細胞或與功能性藥物抗體結合，降低藥效和耐藥性。 許多研究表明，晚期腫瘤細胞分泌的外泌體可以抑制抗腫瘤免疫反應，促進腫瘤的生長和擴散。 近年來，外泌體在腫瘤應用中產生了許多新的干預措施，例如阻斷外泌體的產生、分泌和阻斷外泌體介導的細胞通訊。
5.誘導性強，可應用於再生醫學
外泌體還具有誘導細胞**和分化的功能，可以促進間充質幹細胞（MSCs）分化為不同的細胞，以替代受損的組織細胞，用於再生醫學領域。 例如，從人臍帶間充質幹細胞的條件培養基中提取的外泌體可以促進細胞的增殖和遷移，抑制線粒體凋亡訊號通路，從而促進第一傷口的修復。 多家公司開發了基於外泌體的再生醫學產品，涵蓋傷口再生、藥妝產品、美容等領域。
外泌體研究整體方法：
圖：整個外泌體研究方案的流程圖。
外泌體鑑定：
在上一期文章《國家自然研究熱點“常青樹”——外泌體簡介》中，我給大家詳細介紹了外泌體提取純化的各種方法。 外泌體分離純化後，需要進行表徵，以確定純化效果，並評估所得的外泌體是否滿足下游實驗的需要。 外泌體的表徵和鑑定方法很多，分析的指標也是多方面的尺寸、形態、表面標記這三個方面的檢測是最重要的，是國際細胞外囊泡學會（ISEV）推薦的用於表徵分離外泌體的方法。
1. 外泌體大小和形態學鑑定——電子顯微鏡
電子顯微鏡，如掃瞄電子顯微鏡（SEM）或透射電子顯微鏡（TEM）可以視覺化顆粒的形態，因此可用於識別外泌體的存在和完整性。 操作步驟大致如下：將提取的外泌體用PBS重懸，滴在孔徑為2nm的樣品銅網上，室溫靜置2min，用濾紙吸收濾網側面的液體，用3%磷鎢酸溶液在室溫下陰性染色5min， 濾紙吸收負性染色液，室溫乾燥，用電子顯微鏡觀察拍照。外泌體在電子顯微鏡下具有非常明顯的膜邊界，是30至150nm不同尺寸的碟形或杯狀結構（在200nm以下也有其他形狀難以識別的外泌體）。
圖：用於檢測外泌體形態的電子顯微鏡。
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2.外泌體粒徑濃度的檢測——奈米顆粒示蹤劑分析（NTA）。
NTA技術可以檢測外泌體的粒徑和數量，操作步驟為：將收集的外泌體用PBS稀釋至106ml，用1ml注射器注入奈米顆粒跟蹤分析儀; 雷射束穿過樣品室外的樣品顆粒，通過配備相機的顯微鏡對顆粒進行視覺化，捕獲外泌體的布朗運動，最後利用方程根據其運動計算濃度和流體動力學直徑。 與其他外泌體鑑定方法相比，NTA技術具有更簡單的樣品處理，更好地保證了外泌體的原始狀態，檢測速度更快。
圖 NTA檢測外泌體粒徑濃度。
3. 外泌體表面標誌物的鑑定-WB檢測
外泌體生化分析鑑定主要是檢測其攜帶的特定蛋白標記物，WB檢測是外泌體特異性蛋白（如四跨膜蛋白、腫瘤易感基因101蛋白、脂筏標記蛋白、凋亡誘導因子6相互作用蛋白等）的常用分析技術。 具體操作參考標準WB操作，採用外泌體特異性蛋白的抗體進行標記，從而定性檢測分析外泌體。
圖 WB 檢測外泌體特徵蛋白。
還有其他方法可用於鑑定外泌體，如ELISA、流式細胞術和質譜法，這些方法也常用於檢測外泌體的數量和表面標誌蛋白（如CD9、CD63和CD81）的表達。
外泌體定量檢測試劑盒介紹：
ABSIN ELISA夾心檢測試劑盒（ABS50054）採用高效能抗CD9捕獲和抗CD81檢測抗體檢測人體液或細胞培養上清液，靈敏定量地檢測共表達外泌體表面標誌物CD9和CD81的靶標，實現對樣品中完整外泌體的快速準確定量。
圖 外泌體定量檢測試劑盒的原理。
產品組成：
協議程式：
1.試劑製備
1）所有試劑在室溫下至少15min平衡後使用;
2）取濃縮化妝水溶液，用蒸餾水或去離子水將20倍濃縮洗滌液稀釋成1倍工作液，混勻後備用;
3）顯色底物溶液應在A和B之間按1：1混合後再檢測。
二、實驗過程
1）準備好板條，充分搖勻試劑;
2）用移液管取100 L標準SO-S5，並將待測樣品加入微孔板中。
3）用密封膜密封板孔，37、60min;
4）將工作液洗滌3次，每次300-350公升孔，將板孔內殘液拍在吸水紙上;
5） 每孔加入 100 l 酶偶聯物;
6）用密封膜密封板孔，37、60min;
7）洗滌工作液3次，每孔300-350公升，用吸水紙拍乾;
8）向反應孔中加入顯色底物溶液工作液100 L，避光30min，加終止液50 L，在酶標儀上以450nm處讀數，繪製XY線性曲線。
3. 校準程式
XY線性擬合，線性相關係數r 099.為每個實驗做一整套校準器，並畫曲線。
引用
1] 石玉曉， 盧曉紅， 盧旺丁， 等. 外泌體的生物學特性及應用綜述[J].中國醫藥工業，2023,54（07）：1008-1019doi:10.16522/j.cnki.cjph.2023.07.004.
2] wu y, deng w, klinke dj 2nd. exosomes: improved methods to characterize their morphology, rna content, and surface protein biomarkers. analyst. 2015 oct 7;140(19):6631-42. doi: 10.1039/c5an00688k. pmid: 26332016; pmcid: pmc4986832.
3] wang y, zhang l, li y, chen l, wang x, guo w, zhang x, qin g, he sh, zimmerman a, liu y, kim im, weintraub nl, tang y. exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective mirnas and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium. int j cardiol. 2015 aug 1;192:61-9. doi: 10.1016/j.ijcard.2015.05.020. epub 2015 may 8. pmid: 26000464; pmcid: pmc4469495.
4] 南德.脂肪幹細胞外泌體的分離鑑定及薑黃素遞送體外抗肝癌研究[D].大連理工大學， 2021doi:10.26991/d.cnki.gdllu.2020.001248.