細胞**的配方和製造工藝的效率和功效都受到冷凍的影響，因此有必要了解冷凍儲存對細胞的影響，以便細胞**的成功商業化生產。 在這項研究中，研究人員研究了某些工藝引數 （CPP） 對人 PAN CD3+ T 細胞解凍後存活率、啟用後擴增和細胞因子分泌的影響，以評估這些引數在冷凍儲存過程中的重要性。
本研究的CPPS引數包括凍存溶液配方、DMSO含量、解凍後（預稀釋洗滌）穩定性和活化時間線，並通過膜完整性、增殖率和活化後INFY分泌來評估活性，以表徵細胞和凍存過程。
·細胞培養
通過解凍人PAN CD3 + T細胞將細胞接種在6孔板中，解凍後1小時，用抗CD3 CD28 CD2 T細胞啟用劑啟用細胞，並將細胞培養板置於37°C和5%CO 2的培養箱中10天，並將細胞從培養箱中取出以收集細胞用於製劑和冷凍儲存。
·低溫儲存溶液選擇
四種不同的冷凍儲存解決方案，Cryostor CS5、Cryostor CS10 和 2 種常見的實驗室自製冷凍儲存解決方案。 用於冷凍儲存的 T 細胞。 兩種自製配方含有 Normosol-R 或 Plasmalyte （PLA） 和相同的成分，即 5% W V 重組人血清白蛋白和 10% V DMSO（BloodStor 100，BioLife Solutions）。
·冷凍儲存
從培養箱中取出含有細胞的培養基，並收集在15ml離心管中。 冷凍前取出每組樣品以評估計數和活力。 將T細胞沉澱球化並重懸於冷凍儲存溶液中。 以 1 ml 體積分布在 2 ml 冷凍管中，並將細胞在 2-8C 下孵育 15 分鐘。 然後將小瓶移至程式化的冷卻器中，以-1°C分鐘冷卻，並在10°C下手動成核。 達到-70°C後，將小瓶轉移到LN 2中儲存至少24小時。
·除霜和評估
將樣品在37°C水浴中解凍，然後以1：10的比例重懸於預熱的XF T細胞培養基中。 解凍後立即收集樣品進行活力和計數測量。 將每個細胞組接種在常規6孔板的2個孔中，乙個孔用於靜息對照，乙個孔用於評估活化。 解凍後，加入抗CD3 CD28 CD2啟用試劑進行活化。 此時，將 6 孔板轉移到含有 37% 和 5% CO 2 的培養箱中，用於以下一系列研究
1-為了研究活化前靜息的效果，將一組T細胞樣品冷凍儲存在Cryostor CS5中，並在解凍後培養物中靜置24小時後活化。
2- 為了研究DMSO濃度的影響，比較了在CryoStor CS5和CryoStor CS10中冷凍儲存的兩組T細胞樣品，分別具有5%和10%的v DMSO。
3-為了研究解凍後細胞處理前細胞靜息期的必要性，在進一步處理之前，將一組樣品在解凍後立即在室溫下放置1小時。
對於所有樣品，在解凍後 24 小時和 72 小時，從每個孔中取出一小塊以評估活力、計數 （Chemometec NC-3000） 並檢測 Infy 分泌 （ELISA）。
1、即食型市售CS10及自製配方凍存液的影響研究
在DMSO含量相近的10% V V的3組不同組中，CS10組的活力恢復速度快於其他2組自製凍存溶液，與未冷凍的T細胞對照組接近。
T細胞活化後，各組T細胞活力均下降，解凍後72 hCS10組細胞活力與解凍對照組最接近，且在統計學上也高於其他2個自製凍存組。
總體而言，對使用 10% DMSO 的 3 組冷凍儲存溶液進行比較，發現解凍和活化存活率之間的活力差異不大。 然而，在解凍後72 h，三組間擴增和INFY分泌差異有統計學意義。 在 CryoStor CS10 中冷凍儲存的細胞數量在 72 h 內增加到與解凍對照相同的水平，高於其他兩組在 Normosol HSA 和 PLA HSA 冷凍儲存溶液中冷凍儲存的細胞數量。 INFY比較也是如此：CS10組的分泌水平明顯高於其他組，僅略低於未冷凍的對照組。
2. DMSO濃度影響的研究
通過比較Cryostor CS5和CS10製劑（分別為5%和10% V DMSO）的影響，研究了在冷凍儲存溶液配方中增加DMSO濃度對細胞凍存的影響。
從圖2可以看出，CS10組解凍後72 h的活力低於活化的CS5組，但CS10組的細胞擴增率顯著高於CS5組，INFY的分泌也顯著高於CS5組。 此外，必須提到的是，在細胞活力和擴增潛力方面，較低DMSO濃度下冷凍儲存細胞的效能（5%V v下的Cryostor CS5）與實驗室製造的10% V DMSO冷凍儲存的效能相當。 與含有 10% v DMSO 的自製 PLA 製劑相比，CS5 冷凍儲存的細胞分泌更多的 INFY。
3. 解凍後細胞處理前細胞靜置期必要性研究
T細胞解凍後3種不同啟用方案的比較：
1）解凍後立即處理並啟用。
2）解凍後等待（1小時）進行進一步處理。
3）處理後24小時活化並孵育。
從圖中可以看出，活化導致細胞解凍後短時間內失去活力。 因此，據推測，確保在啟用前解凍後（在這種情況下為 24 小時）有乙個細胞靜息期可能有助於減少細胞損失和提高擴增率。
然而，解凍後的穩定性是細胞製造和實踐中的乙個風險問題，建議在洗滌或患者給藥之前提前了解解凍後細胞保持穩定多長時間。 本研究的結果表明，與解凍後立即處理的樣品相比，在室溫（20-25°C）下解凍後等待1小時對細胞擴增能力和INFY分泌的影響更大，有趣的是，細胞活力在1小時等待組中保持統計學上沒有變化，因此僅存活率不足以評估這些工藝引數對T細胞質量的影響。 此外，觀察到解凍後和活化前在培養基中孵育 24 小時並不一定能減少活化後細胞活力的損失（圖 2）。
與傳統的實驗室製備凍儲存溶液相比，CryoStor 是一種更可靠的人 CD3+ T 細胞凍存配方，即人 CD3+ T 細胞凍存液中冷凍儲存的其他人 CD3+ T 細胞與其他兩種測試配方相比，Normosol-R + 5% W V RhSA + 10% V V DMSO 和 Plasmalyte-A + 5% W V Rhsa + 10% V V DMSO， 解凍後顯示出增強或至少同等的質量和功能。
此外，在較低DMSO濃度（5%VV）下冷凍儲存的細胞的效能與使用10%VV DMSO的實驗室製造的冷凍儲存溶液相當，這表明使用冷凍儲存溶液（如冷凍器配方）是降低產品中DMSO含量的潛在方法。
與 Cryostor 的兩種冷凍儲存產品相比，較高濃度的 DMSO （10% Vv） 似乎比較低濃度的 DMSO （5% Vv） 更有效地儲存人類 T 細胞。
在解凍後相同的時間，靜息培養物的擴增率和INFY分泌量明顯低於即刻細胞活化組，這表明解凍後立即活化T細胞可能更有益，以優化製造時間。
有關BioLife冷凍儲存解決方案的更多問題，歡迎來到Mambo Biotech！
關注 Mambo Bio*** 檢視更多技術文章！