中華人民共和國國家標準
gb 31658.20-2022
食品安全國家標準
動物性食品中醯胺醇及其代謝物殘留的測定
液相色譜串聯質譜
national food safety standard-
determination of amphenicols and metabolite residues in animal
derived food by liquid chromatography-tandem mass spectrometry method
範圍
本檔案規定了用於測定動物性食品中醯胺類酒精藥物及其代謝物殘留的樣品製備和液相色譜-串聯質譜測定方法。
本檔案適用於豬、雞、牛、羊肌肉、肝臟、腎臟、脂肪組織以及雞蛋、牛奶和山羊奶中氯黴素、硫黴素、氟苯尼考和氟苯尼考醯胺殘留的測定。
規範性參考文獻
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GB T 6682 分析實驗室用水規範和試驗方法。
術語和定義
本文件中沒有需要定義的術語和定義。
原則
用2%氨化乙酸乙酯溶液提取樣品中殘留的氯黴素、硫黴素、氟苯尼考和氟苯尼考醯胺，經正己烷脫脂，氨化乙酸乙酯反萃提取，液相色譜-串聯質譜法測定，內標法定量。
試劑和材料
除另有規定外，所有試劑均為分析純水，水為符合GB T 6682的1級水。
5.1 試劑。
5.1.1 甲醇（CH3OH）：色譜純。
5. 1.2 乙腈（CH3CN）：色譜純。
5. 1.3氨（NH3·H2O）。
5. 1.4乙酸乙酯（C4H8O2）。
5.1.5 無水硫酸鈉（Na2SO4）。
5.1.6 氯化鈉 （NaCl）。
5.1.7 甲酸銨 （HCOONH4）。
5.1.8 正己烷（C6H14）。
5.2.溶液製備。
5.2.1 2%氨化乙酸乙酯溶液：取氨水20ml，用乙酸乙酯稀釋至1 000ml。
5.2.2 4%氯化鈉溶液：取氯化鈉4g，溶於水中，稀釋至100ml。
5.2.3 4%氯化鈉飽和正己烷：取4%氯化鈉溶液適量，加過量正己烷，混合，靜置分層，取上層正己烷。
5.2.4 20%甲醇溶液：取甲醇20ml，用水稀釋至100ml。
5.2.5 10 mmol L甲酸銨溶液：取甲酸銨063 g，溶於水並稀釋至1 000 ml。
5.3 標準。
氯黴素、硫黴素、氟苯尼考和氟苯尼考醯胺均為99%，氯黴素-d5、硫黴素-d3、氟苯尼考-d3和氟苯尼考醯胺-d3均為98%，詳見附錄A。
5.4.標準溶液的製備。
5.4.1.標準貯液：取氯黴素、硫黴素、氟苯尼考和氟苯尼考醯胺標準品適量（相當於各有效成分約10mg），精密稱定，加甲醇適量溶解稀釋置100ml容量瓶中，配製濃度為100ml的標準儲備液，濃度為100ml。 -18 以下內容將保留 12 個月。
5.4.2.內標原液：取氯黴素-d5、硫黴素-d3、氟苯尼考-d3、氟苯可拉胺-d3內標適量（相當於各有效成分約1mg），精密稱定，加甲醇適量溶解稀釋置10ml容量瓶中，配製濃度為100 g ml的內標儲備液。 -18 以下內容將保留 12 個月。
5.4.3.混合標準中間溶液：01ml，美太黴素、氟苯尼考和氟苯可拉胺標準儲備溶液各0ml在10ml容量瓶中5ml，用甲醇稀釋至刻度，製備濃度為1g ml氯黴素和濃度為5g ml硫蟲素，氟苯尼考和氟苯可拉胺的混合標準中間溶液。 -18 以下內容將儲存 3 個月。
5.4.4.混合內標中間溶液：01 ml，美太黴素-D3、氟苯尼考-D3 和氟苯尼考拉胺-D3 內標原液各 0 個5ml，在10ml容量瓶中用甲醇稀釋至刻度，用濃度為1g ml的氯黴素-D5和濃度為5g ml的硫黴素-D3、氟苯尼考-D3和氟苯胺-D3製備混合內標中間體。 -18 以下內容將儲存 3 個月。
5.4.5.混合內標工作液：取混合的內標中間溶液，用20%甲醇溶液稀釋成濃度為10 ng ml的氯黴素-d5，以及濃度為50 ng ml的磺黴素-d3、氟苯尼考-d3、氟苯蔻胺混合內標工作液，即取，即取。
5.5 材料。
尼龍微孔膜：m
儀器裝置
6.1 液相色譜-串聯質譜儀：功率分布噴霧離子源 （ESI）。
6.2 平衡：電感 00001 g 和 001 g。
6.3 均質機。
6.4.渦旋混合器。
6.5.多管渦旋振盪器。
6.6 高速冷凍離心機：最高 8 000 轉/分
6.7.吹氮器。
標本的製備和儲存
7.1.樣品的製備。
7.1.1肌肉、肝臟、腎臟和脂肪組織。
取適量的新鮮或解凍的空白或測試組織，將其切碎，並勻漿。
a） 取均質化後的試樣作為試樣;
b）取均質後的空白試樣作為空白試樣;
c）取均質的空白試樣，加入適當濃度的標準工作溶液，作為空白試樣使用。
7.1.2 牛奶。
取適量的新鮮或解凍的空白或測試牛奶或山羊奶，攪拌均勻。
a） 取混合均勻後的試樣作為試樣;
b）混合均勻後取空白樣品，作為空白樣品;
c）取均質的空白試樣，加入適當濃度的標準工作溶液，作為空白試樣使用。
7.1.3個雞蛋。
取適量的新鮮或冷藏的空白或試蛋，去殼，勻漿。
a） 取均質化後的試樣作為試樣;
b）取均質後的空白試樣作為空白試樣;
c）取均質的空白試樣，加入適當濃度的標準工作溶液，作為空白試樣使用。
7.2.樣品的儲存。
18 儲存在下面。
檢測步驟
8.1 提取。
取 2 g 樣品（精確到 0.）。05 g），置50ml離心管中，加混合內標工作液100 l，渦旋混勻，再加入2%氨化乙酸乙酯溶液10ml（牛奶和山羊奶樣品中應加入3g無水硫酸鈉），渦旋30 s，渦旋10 min， 並以8 000 r分鐘離心5分鐘。 將上清液轉移到另乙個50ml離心管中，向殘留物中加入10ml 2%氨化乙酸乙酯溶液，重複提取一次。 將兩種提取物合併，在50°C氮氣中乾燥，並純化。
8.2 淨化。
取待純化的殘渣，加4%氯化鈉溶液3ml，渦旋溶解，再加4%氯化鈉飽和的正己烷5ml，渦旋30s，8 000 rmin離心5 min，棄去上層正己烷層，用4%氯化鈉飽和的正己烷重複脫脂。 加入5ml 2%氨化乙酸乙酯溶液，渦旋5分鐘，以8 000r分鐘離心5分鐘，取上層有機相。 用5ml 2%氨化乙酸乙酯溶液重複提取一次，合併有機相，用50氮氣吹乾，加入20%甲醇溶液10 ml，渦旋 30 秒，超過 0用於液相色譜串聯質譜的 22 m 濾膜。
8.3.標準曲線的準備。
精密量取混合標準中間體溶液與混合內標工作液適量，用20%甲醇溶液稀釋，配製濃度為0的氯黴素2 μg/l、0.5 g l、1 g l、2 g l、5 g l、10 g l、硫黴素、氟苯尼考和氟苯尼考的濃度分別為1 g l和25 g L、5 g L、10 g L、25 g L、50 g L，氯黴素-D5濃度為1 g L，硫黴素-D3、氟苯尼考-D3、氟苯尼考醯胺-D3濃度為5 g L，準備進行液相色譜串聯質譜測定。 以定量離子峰面積比為縱坐標，濃度為橫坐標繪製標準曲線，得到回歸方程和相關係數。
8.4 測定。
8.4.1 液相色譜參考條件。
a） 列：c18列 （100 mm2.1 mmm或同等學歷;
b） 柱溫：30;
c） 注射量：5 l;
d） 流量：03 ml/min；
e）流動相：a為10mmoll甲酸銨溶液;b為乙腈; 梯度洗脫程式如表1所示。
8.4.2質譜參考條件。
a） 離子源：電噴霧離子源;
b）掃瞄方式：正離子掃瞄、負離子掃瞄;
c）檢測方法：多反應離子監測（MRM）;
d） 脫溶劑氣、錐形氣體和碰撞氣體均為高純氮氣或其他適宜氣體;
e） 噴霧電壓和碰撞能量等引數應優化至最佳靈敏度;
f） 分析物離子源、定性離子對、定量離子對、錐體電壓和碰撞能量的參考值見表2。
8.4.3 測定。
8.4.3.1.定性測定。
在相同試驗條件下，醯胺醇及其代謝物在試樣溶液中的保留時間與醯胺醇及其代謝物在標準工作溶液中的保留時間的相對偏差為25%，並且檢測到的相對離子豐度應與可比濃度的校準標準溶液的相對離子豐度一致。 允許偏差應符合表3的要求。
8.4.3.2 定量測定。
將供試品溶液與相應的標準溶液在單點或多點進行校準，按內標法按色譜峰面積比定量。 醯胺醇及其代謝物與標準溶液和樣品溶液中相應內標峰面積的比值應在儀器的線性範圍內。 對於超出儀器線性範圍的殘留物，根據提取時藥物濃度相應增加內標工作液的加入量，使供試品溶液稀釋後的醯胺醇及其代謝物濃度在曲線範圍內，相應的內標濃度與標準工作溶液一致。 標準溶液的特徵離子質量色譜圖見附錄B。
8.5 空白測試。
取空白樣品，除不新增藥物外，使用完全相同的測定步驟進行測定。
結果的計算和呈現
根據標準曲線或式（1）計算樣品中醯胺醇及其代謝物的殘留量。
其中：x-樣品中醯胺類酒精藥物及其代謝物的殘留值，單位為微克/千克（g kg）;
CIS - 樣品溶液中醯胺醇及其代謝物的內標濃度值，單位為微克/公升（g l）;
CS - 標準溶液中醯胺醇及其代謝物的濃度，單位為微克/公升（g L）;
c'是 - 標準溶液中醯胺醇及其代謝物的內標濃度值，單位為微克/公升（g l）;
AI - 樣品溶液中醯胺醇及其代謝物的峰面積;
AIS——醯胺醇及其代謝物在試樣溶液中內標的峰面積;
AS - 標準溶液中醯胺醇及其代謝物的峰面積;
a'是——標準溶液中醯胺醇及其代謝物內標的峰面積;
v - 溶解殘渣的20%甲醇溶液的體積值，單位為毫公升（ml）;
m – 試樣質量的數值，單位為克 （g）。
方法靈敏度、準確度和精密度
10.1靈敏度。
該方法中氯黴素的檢出限為01 g kg，定量限為02 μg/kg；硫菌素、氟苯尼考和氟苯尼考醯胺的檢出限為05 g kg，定量限為 1 g kg。
10.2 準確性。
這種方法氯黴素在02 g kg、1 g kg、1 g kg、1 g kg、100 g kg、氟苯尼考和醯胺在1 g kg、6 000 g kg、**加成濃度、70%、120%的加成濃度水平。
10.3 精度。
該方法的相對標準偏差在測定內為15%，測定之間的相對標準偏差為20%。
*從：