螢光蛋白作為一種分子探針，它可以特異性標記靶蛋白、細胞結構和細胞器，在活細胞成像和超解像度顯微鏡中起著至關重要的作用。 其亮度和光穩定性是衡量螢光蛋白在螢光顯微鏡中應用價值的核心指標。 自1992年成功轉殖出第一種綠色螢光蛋白（GFP）以來，科學家們一直致力於改進螢光蛋白的這兩個關鍵特性，以擴大其在成像技術中的應用。 最近，乙個派生自 CUchidae 水母的綠色螢光蛋白被發現特別具有光穩定性，遠遠優於任何已知的螢光蛋白，並且被設計成與助記符一樣明亮，因此得名staygold。然而，staygold本身是一種二聚體，限制了其作為螢光標記工具的應用範圍。 2024年2月26日，西湖大學生命科學學院kiryl piatkevich該研究小組與莫斯科國立大學聯合fedor subach研究小組在nature methods該雜誌發表了一篇文章bright and stable monomeric fluorescent protein derived from staygold。他們選擇利用定向進化的策略，成功開發了StayGold的單體版本，命名為MBAOJIN。這種螢光單體不僅繼承了原始蛋白質的優良效能，而且具有更廣泛的應用潛力。 通過分析MBAOJIN在不同pH條件下的晶體結構，並將其與StayGold和其他主流螢光蛋白進行比較，還揭示了單體化所必需的關鍵氨基酸突變，並進一步闡明了其優異光穩定性的分子機制。 MBAOJIN的高亮度和光穩定性，加上其優異的化學穩定性，使其成為研究細胞和亞細胞結構形態和動態變化的理想螢光蛋白工具，尤其是超分辨顯微鏡和擴增顯微鏡。 
持續時間： 00：11
為了單聚化二聚體綠色螢光蛋白StayGold，作者通過將SatyGold的突變文庫與ARAC蛋白的DNA結合域（aracDNA）融合，構建了圖1A中的蛋白質表達載體。 當突變體為單體時，與ARAC融合的突變蛋白驅動報告基因mtagbfp的表達水平相對較低。 當突變體為二聚體時，與ARAC融合的突變蛋白驅動報告基因mtagbfp的表達水平相對較高。 在每一輪隨機突變中，作者選擇具有深藍色螢光和最亮綠色螢光的菌落，並通過液相色譜法確認其寡聚狀態。 經過八輪定向進化，最終確定了亮度最高的綠色螢光蛋白單體，並以mneongreen蛋白的N端和C端為接頭肽，保證在哺乳動物細胞中的穩定表達，命名為mbaojin。 與StayGold的氨基酸序列一致，mbaojin具有以下突變：S55T、H77R、E80G、Q140P、H141Q、C165Y、N171Y和T201A。 為了檢測mbaojin在哺乳動物細胞中是否是單體的，作者在hela細胞中表達了融合到內質網錨結構域（cyterm）的mbaojin，並計算了沒有渦旋結構的健康細胞的比例。 使用串聯和單體版本的 StayGold（TD8OxSTAYGOLD、StayGold-E138D 和 MstayGold，也稱為 QC2-6 FIQ）作為比較，並使用經過驗證的單體（MEGFP、MCLover3、MGreenLantern）和弱二聚體（EGFP、Venus）進行比較。 Mbaojin 有乙個分數是 93 分7%，達到細胞中單體化的閾值。 這些結果證實了mbaojin是一種單體蛋白。 
單體化 staygoldmbaojin的晶體結構在文章中，作者解析了 mbaojin 的 ph 值。 6 和 8將5處的X射線晶體結構與STAYGOLD的二聚體結構進行比較，發現MBAOJIN的結構在不同pH值下差異無統計學意義，MBAOJIN的二聚體介面與亞基A和B之間的接觸較少，螢光團附近的氯離子口袋在MBAOJIN的所有結構中都與STAYGOLD相似且相似。 為了進一步了解MBAOJIN增強光穩定性的分子基礎，作者在與螢光團相互作用的位點（以PDB編號）進行了氨基酸的點突變。 結果表明，mbaojin N137K、mbaojin S134p和mbaojin V152e突變體的光漂白率為15-6.5 和 45次。 比較可光漂Mbaojin蛋白和較少光漂白的Mneongreen和EGFP蛋白的螢光團環境，發現可光漂白的Mbaojin蛋白在螢光團周圍形成了更多的氫鍵和疏水鍵。 表徵了mbaojin在細胞和純化蛋白中的理化性質在驗證了mbaojin是一種單體蛋白後，作者進一步表徵了純化的mbaojin蛋白的光譜和生化性質。 研究發現，與StayGold相比，mBaojin產生的單體化突變並未改變其吸收和螢光光譜特性。 但是，mbaojin的分子亮度比staygold低109 倍，但比 mneongreen 亮 1 倍24倍。 在低激發強度（約13 mW mm2，活細胞成像條件下），MBAOJIN的光穩定性分別比EGFP、mneongreen和mgreenlantern高15倍、9倍和130倍，儘管這種差異在高功率（約120 mW mm2）下不太顯著。 Mbaojin 在 37 歲時迅速成熟，成熟時間為 75 分鐘，比 StayGold、Mneongreen 和 EGFP 快 1 分鐘8 次，22x 和 18倍，成熟最快的螢光蛋白之一。 此外，MBAOJIN的螢光表現出極高的化學穩定性，與其他單體GFP相比，pH值穩定高達437。在6 M GDNHCL中孵育24 h後，MBAOJIN的螢光增加了18%，而化學最穩定的螢光蛋白之一HFYFP的螢光僅增加了1%，StayGold的螢光降低了2%，MneonGreen的螢光完全猝滅。 在HEK和HELA細胞中，mBaojin與紅色螢光蛋白（Fusionred或mcherry）通過P2A共表達，紅色螢光使蛋白的表達水平歸一化。 與EGFP相比，MBAOJIN在HEK和HeLa細胞中的細胞內亮度始終高出約70-140%，同時與（N1）StayGold（C4）和MstayGold相當。 此外，擴增顯微鏡預處理的HEK細胞中mbaojin的亮度分別是mneongreen、hfyfp和mstaygold的17倍4 次，38次。 在對HEK細胞進行的光漂白實驗中，作者使用了35倍的照明功率（即50倍）5 mW mm2），以便可以在更短的時間內觀察到光漂白速率的差異。除了 staygold 及其衍生的螢光蛋白外，還有 1朝九比二MBAOJIN的光穩定性是其3倍，其光漂白速度是現有GFPS的4倍6 至 85 次。 StayGold 的串聯二聚體 TD8OX2STAYGOLD 在亮度和光穩定性方面優於所有經過測試的 GFP，在 HEK 電池中表現最佳。 mbaojin的活細胞成像和超解像度顯微鏡Mbaojin與波形蛋白、人細胞色素c氧化酶亞基viii、h2b、角蛋白、微管蛋白、肌動蛋白等結構蛋白融合後成像。 作者使用超分辨共聚焦顯微鏡對mbaojin和mneogreen的融合蛋白進行長達60分鐘的成像，mbaojin沒有進行光漂白，而mneongreen在相同條件下將初始螢光值降低了25%。 然後使用稀疏去卷積結構照明顯微鏡對活細胞中的肌動蛋白纖維進行成像，在更高的光照功率（150-200 MW mm2）下，Mbaojin的光穩定性比MneonGreen高2.。5-4次。 **在蠕蟲中，mbaojin 在神經元細胞內亮度較強的神經元中表現出比 mneongreen 慢 4 倍的光漂白速度，在光漂白 15 分鐘後保留 50% 以上的初始螢光。 在活的小鼠腦組織中，mbaojin 比 mneongreen 更亮7 倍，但比 mstaygold 深 1 倍7次。 然而，在PFA固定的腦組織中，MstayGold和Mbaojin表現出相當的亮度和光穩定性，明顯優於MneonGreen。 由於其高化學穩定性，MBAOJIN 用於線粒體、微絲微管和 HeLa 細胞小鼠腦組織的擴充套件顯微鏡成像。 重要地MBAOJIN還在擴充套件的腦組織中保持其高光穩定性，在減少光漂白的同時實現大體積超解像度成像。 Kiryl D.，西湖大學研究員皮亞特克維奇和莫斯科國立大學費多爾五世Subach教授是《**》、《Hanbin Zhang》、《西湖大學博士生》和《Gleb D.》的共同通訊作者Lesnov博士是該論文的共同第一作者，西湖大學博士生Wenhao Zhang和研究助理St**rini Papadaki參與了部分研究。 **專案中使用的質粒可以通過西湖實驗的質粒平台免費獲得：。 此外，基麗爾 D2023年，Piatkevich在Nature Methods上發表了一篇關於近紅外螢光蛋白系統表徵的論文，相關質粒也可在Westlake實驗的質粒平台上獲得。 Wekwikgene是中國第乙個質粒庫，由Piatkevich教授發起，由西湖生命科學與生物醫學實驗室資助。 所有質粒都經過嚴格的質量控制和測試。 在**上，您可以找到每個質粒的完整序列，同時它提供了使用者友好的體驗，支援建立使用者帳戶和實驗室頁面，並提供了提高科學工作可見性的機會。 Wekwikgene保證快速、免費地交付高質量質粒，以支援和促進開放科學。 原文鏈結：
引用
1. a highly photostable and bright green fluorescent protein |nature biotechnology
熱點引擎程式