**： Yakudo Cyber
JAK-STAT細胞因子在免疫調節中至關重要，當JAK-STAT訊號通路不斷被細胞因子啟用時，容易導致哮喘等慢性炎症性疾病的發生。 阿斯利康披露了一種高選擇性ATP競爭性JAK-1抑制劑的發現和優化過程。 首先，先前報道的JAK抑制劑化合物作為先導化合物，通過合理的藥物設計，優化肺部位的活性、選擇性和PK特性等，獲得該化合物azd4604）。目前，該化合物已進入哮喘的II期臨床試驗。 本文梳理了一下azd4604設計策略和優化路線可以為類似專案的結構優化提供寶貴的經驗。
fig1.臨床候選藥物Azd4604（化合物。） 的優化過程。
JAK激酶是一類訊號分子，可表達I型和II型細胞因子受體的細胞內結構，屬於酪氨酸激酶的非受體類。 JAK激酶包含兩個幾乎相同的磷酸轉移結構域，當細胞因子與細胞膜外的受體結合時，細胞因子受體被啟用，訊號被傳遞到JAK激酶，然後磷酸化，並進一步磷酸化下游分子STAT，磷酸化的STAT可以作為轉錄因子複合物的一部分進入細胞核， 控制細胞基因的轉錄，影響細胞的生物學功能，這種細胞因子傳導途徑稱為“JAK-stat”通路。JAK家族由JAK1、JAK2、JAK3和TYK2四個成員組成，它們在成員之間是序列保守的，但不同成員的組合形成了不同細胞因子受體的細胞內訊號轉導接頭蛋白，因此它們也控制著不同的細胞因子通路。
目前臨床上使用的抑制劑均為活化抑制劑，其化學結構與ATP相似，能形成與ATP核苷相似的氫鍵，並且比ATP具有更強的親和力，從而佔據ATP的結合位點，導致JAK激酶功能受阻，進而預防下游途徑引起的相關疾病。 由於JAK家族的四個成員具有高度的保守性，輝瑞公司的托法替尼和禮來公司的巴瑞替尼等上市藥物對JAK-STAT訊號傳導的抑制是非選擇性的，這可能與臨床上嚴重的不良反應有關。 目前，JAK抑制劑已被開發為選擇性抑制，僅抑制乙個或多個JAK家族成員，理論上可降低臨床不良事件的發生率。
據JMC最近報道，阿斯利康對JAK抑制劑進行了長期研究azd4604的發現工作。 通過預篩選獲得的化合物作為先導化合物，通過合理的藥物設計，可以獲得具有優異效力、高選擇性和藥代動力學特性的可吸入JAK1抑制劑化合物azd4604），並成功進入II期臨床試驗階段。
設計和優化過程總結如下：
HIT發現
該公司的口服JAK1選擇性抑制劑專案發現了許多JAK抑制劑，研究人員從中選擇了化合物作為先導化合物。 （化合物。它具有優異的JAK1選擇性，對JAK2的選擇性超過1000倍，因此與JAK2相關的副反應將大大減少，但PK性質需要優化。
SAR 探索
一般來說，分子中含有鹼性基團，可以提高化合物與細胞膜或組織的結合，導致組織分布高，進而影響半衰期和作用時間，對增加吸入器的給藥間隔更有利。 因此，從化合物優化結構中甲基哌嗪基團的氮原子，提高與肺組織的親和力，提高藥物在肺中的保留時間。
已經表明，鹼性分子與組織的結合是由於化合物與帶負電荷的磷脂頭基之間的相互作用，從而進入磷脂層。 因此，化合物的親脂性可能有助於提高組織親和力。 除了良好的肺組織保留時間外，還需要高活性，以減少施用的劑量並滿足乾粉肺組織遞送裝置的容量（通常為1-2mg倍）。
研究人員合成了近100種化合物類似物來改善活性和肺保留時間的性質，並測試了這些化合物的活性和選擇性以及細胞實驗。 結果表明，JAK1酶的抑制活性與細胞實驗結果相關性較好，而親脂性（logd）與活性無關，且化合物對映異構體的活性存在顯著差異。
（化合物。親脂性（logd）約為24-3.3.有利於延長肺瀦留時間，水溶性約6-38um，用azd0449（logd=4.2.水溶性=003um），顯示出顯著差異。從構效關係分析來看，5-甲基嘧啶衍生物的活性略優於5-氟嘧啶系列，但可以通過置換環上的取代基來改變活性。 所有化合物均被JAK3滅活，並在細胞實驗中表現出對IL-4和IL-13誘導的STAT6磷酸化的強烈抑制（IC50約為13-56nM）。 鑑於使用相似的人血漿蛋白競爭與這些化合物的結合並未顯示出顯著的蛋白質結合依賴性活性降低，這表明該細胞實驗的結果可以作為化合物活性分選的基礎。 此外，由於該化合物的陽離子兩親性，親脂性最強的化合物是可能具有次要藥理作用的化合物，例如HERG和磷脂沉積性，這些化合物可能會降低親脂性沒有進行進一步的開發，其餘的化合物進行了進一步的表徵和研究。
fig2.用於吸入給藥的JAK抑制劑結構。
將暴露的 JAK1 結構用於化合物結果表明，結合模式與前人研究結果一致，與L959建立了關鍵相互作用，在吲哚胺、醯胺胺和D1021之間形成雙齒相互作用，與D1003形成手性哌嗪環形成鹽橋。 正如我們之前報道的那樣，我們相信化合物與 D1003 建立的極性相互作用和對 p 環的穩定作用有利於 JAK12 的選擇性。 此外，分子對接表明了兩種新的相互作用，一種是甲氧基甲基片段與K908之間的相互作用，一種是碸官能團在溶劑通道中與R879形成兩點相互作用。 有趣的是，R879 是 JAK 激酶家族 ATP 結合位點中的乙個非保守位點，而 JAK2 中對應的側鏈是 Q853。 讓我們假設化合物與 R879 的相互作用可能有利於增強 JAK1 活性和 JAK2 選擇性。 與化合物相比甲基取代基，結構中的化合物甲氧基甲基片段與K908的相互作用更有利於活性的提高。
fig3.將是化合物分子（粉紅碳骨架）對接到JAK1（PDB：6GGH）的X射線衍射結構中。
fig4.（化合物。azd4604） 的優化過程。
理化性質和ADME
我們收集了有關吸入藥物給藥特性的資料。 令人高興的是，我們發現了化合物和化合物多晶型意味著這些化合物可用於乾粉配方的開發。 由於N-甲基哌嗪中存在氮原子，4種化合物的PKA均接近8。 熔融吸熱資料表明，所有四種化合物都能夠承受製劑開發條件（例如粉碎）。 基於PH65 和 pH 值 7晶體溶解度資料 在4種條件下，這些化合物不太可能在低至中等劑量下表現出溶解度或溶出速率驅動的肺瀦留。 Caco-2透光率表明，這些化合物可以穿過肺組織和細胞膜到達細胞內靶點。 在大鼠靜脈內給藥後，穩態分布容積（VDSS）約為9-11 L kg，這是預期的。 以上資料可以保證該化合物在體內肺組織中的藥代動力學性質。
隨後通過大鼠進行氣管內給藥（i.）。t.對 PK 屬性進行了排名。 從圖中5 看，化合物肺組織中的藥代動力學特性是最佳的，與AUC顯示的高暴露量一致，因此，選擇該化合物進一步評價大鼠DPI的藥代動力學測定。
fig5.大鼠氣管內給藥化合物跟肺PK的時程曲線。
我們開發了化合物克級合成路線在微粉化後可達到理想的粒徑，用於DPI-PK測試。 需要注意的是，粒徑是臨界的，低於 0撥出9微公尺，而超過5微公尺會集中在口咽部和第一氣道吞嚥處，影響藥物的療效。 fig.6表明，該化合物能夠在肺組織中以較高濃度被檢測到此外，IL-4 JAK PSTAT6-LUC試驗的結果表明，當前給藥劑量不會導致血漿峰值濃度高於IC50（24nM）。 也就是說，化合物它可以保留在高濃度的肺組織中，幾乎不需要系統暴露，達到預期的效果。
fig6.（化合物。在大鼠吸入和乾粉給藥後（劑量為 006，0.5，3.07 和 2479ug公斤）。
表4總結了化合物ATP 濃度為 1 mM 時 JAK 家族的活性資料、體外 PK 以及靜脈內和口服給藥後大鼠的 PK 資料。 該化合物對 JAK1 具有亞納摩爾抑制活性，對 JAK2、JAK3 和 TYK2 的選擇性超過 1000 倍。 該化合物在肝微粒體中的穩定性相當可觀，而在肝細胞中更穩定。 大鼠靜脈注射給藥後的PK試驗顯示通過混懸液口服給藥後的化合物它的口服可用性為 f=44%。 鑑於吸入乾粉後肺組織暴露於該化合物的暴露量明顯高於血漿，我們選擇它作為候選藥物。
生物活性評估
JAK-STAT的藥理學研究充分，但依賴於JAK抑制劑的使用，僅顯示出JAK選擇性的微小差異。 因此，剖析特定JAK亞型（尤其是JAK1）的功能一直很困難。 我們使用化合物剖析JAK1在哮喘患者細胞中的功能。
我們從測試化合物開始（JAK1選擇性抑制劑），cp-690550（托法替尼，一種廣譜JAK抑制劑）和jak3i（不可逆JAK3選擇性抑制劑）對CD4+ T細胞增殖和活化的影響，結果表明，3種抑制劑均能劑量依賴性地抑制細胞的增殖和活化。 此外，這三種抑制劑均能有效抑制Th1、Th2和Th17細胞的分化，表現為Th特異性細胞因子（如IL-4、IL-5和IL13）的產生呈劑量依賴性減少。
fig7.JAK抑制劑對不同劑量下Th1、Th2和Th17細胞因子產生的影響。
通過研究 JAK1 和 JAK3 在介導 T 細胞和髓樣細胞中 IL-4 訊號傳導中的作用，我們發現儘管 JAK1 和 JAK3 都參與 IL-4 訊號傳導，但 JAK1 在髓樣細胞活化和單核細胞來源的炎性樹突狀細胞再生方面可能比 JAK3 更重要，這被認為是 IL-4 驅動哮喘的關鍵因素。 這一發現為哮喘發病機制的分子機制提供了重要的見解，並表明靶向JAK1訊號轉導可能是哮喘的一種有前途的策略，因此，化合物azd4604）被選為哮喘等潛在炎症性疾病的候選藥物。
fig8.抑制JAK激酶活性是限制IL-4產生所必需的。
fig9.JAK1 在炎性單核細胞來源的樹突狀細胞的體外發育中起關鍵作用。
結論
JAK1抑制劑（化合物）是通過結構優化具有JAK1選擇性抑制活性的先導化合物而獲得的，可用於口服給藥），對JAK1具有選擇性，對吸入給藥具有優異的藥代動力學特性。為了達到最佳活性，我們的策略是探索和調整鹼性N-甲基哌嗪中的氮原子和脂溶性，以提高與肺組織的親和力並增加保留時間。 我們測試了優選化合物的體外PK特性和體內PK特性，以鑑定化合物有效安全，已進入哮喘II期臨床試驗。 通過使用化合物研究JAK1在哮喘生物學中的功能發現，JAK1在IL-4的訊號轉導中比JAK3更重要，並且鑑於IL-4是哮喘發展的關鍵誘導劑，抑制JAK1成為哮喘的乙個非常有前途的途徑。 我們的研究結果為哮喘發病化合物的研究提供了新的見解它可以通過調節T細胞和骨髓細胞的活性來達到**炎症性疾病的目的。
品**
doi.org/10.1021/acs.jmedchem.3c00554
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