胰腺癌具有高度惡性腫瘤和有限的選擇，被認為是全球健康的主要挑戰。 雖然化療是改善區域性晚期或轉移性胰腺癌預後的最有效手段之一，但化療耐藥性是臨床障礙。胰腺癌最有效的化療方案是葉酸，奧沙利鉑是關鍵的活性劑。 然而，根據目前的資料，只有21%的胰腺癌患者對鉑類藥物敏感。 因此，有必要研究胰腺癌中鉑類耐藥的機制以及如何提高鉑類敏感性，從而為胰腺癌提供思路。
細胞外囊泡（EVS）是一種新的細胞間通訊方式，它攜帶各種生物活性分子來調節受體細胞的活性。 此外，環狀RNA（circRNA）在EV中豐富且穩定，可以在細胞之間發揮特定功能。 已發現外泌體中的 circRNA 在介導肝細胞癌順鉑化療耐藥性中起重要作用。 然而，EV包封的circRNA在胰腺癌鉑類耐藥中的作用尚未得到廣泛探索。
今年6月，廣東省人民醫院陳如福教授團隊在cancer research（if=11.2）發表文章淋巴結轉移性胰腺導管腺癌-circarfgef2的潛在靶點已被探索，為胰腺癌的診斷和發展提供了有力的參考。
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同年11月28日廣東省人民醫院陳如福教授團隊在journal of experimental & clinical cancer research（if=11.3） 再版，CircRNA在胰腺癌診斷中的應用 **方向關於來自癌症相關成纖維細胞的細胞外囊泡包裝的circbirc6的最新文章，在胰腺癌中通過sumoylation調節誘導鉑抗性。 在這項研究中，作者鑑定了一種環狀RNA，CircBIRC6，富集於腫瘤相關成纖維細胞（CAF）產生的EVs中，它在胰腺導管腺癌（PDAC）的化療耐藥性中起關鍵作用。 CircbiRC6在CAF中的表達與奧沙利鉑化療耐藥性呈正相關。 Circbirc6 通過調節非同源末端連線 （NHEJ） 依賴性 DNA 修復來增強胰腺癌細胞和類器官對奧沙利鉑的耐藥性。 這是它的工作原理，CircBIRC6直接與XRC4結合，增強XRC4與SUMO1在賴氨酸115殘基上的相互作用，從而促進XRC4染色質的核定位，增加奧沙利鉑耐藥性。 單獨使用奧拉帕尼與circbirc6和circbirc6聯合使用的抑制劑可顯著抑制奧沙利鉑化療耐藥性。
為了研究鉑類化療耐藥中參與CAF的關鍵環RNA，我們對奧沙利鉑耐藥患者的CAFS和正常鄰近組織相關成纖維細胞（NAF）進行了高通量測序+qPCR分析，並篩選了10個上調的circRNA（圖1A）。 然而，在這些circRNA中，與奧沙利鉑敏感患者相比，CAFS中只有Circbirc6顯著高於奧沙利鉑耐藥患者高表達的 Circbirc6 與較短的無進展生存期 （PFS） 密切相關（圖 1C-E）;在未接受鉑類化療**的患者中，CircBIRC6 表達不再與 PFS 相關（圖 1F）。這表明circbirc6與奧沙利鉑耐藥性密切相關。 CircBIRC6 起源於 BIRC6 基因的外顯子 2 10，通過環形成和 RNA R 和放線菌素 D 實驗驗證了其環化和耐受性（圖 1G-I）。 總結一下技巧，Circbirc6 是一種共價阻斷的環狀 RNA，與奧沙利鉑耐藥性密切相關。
作者進一步闡明了鉑類抗性PDAC中導致Circbirc6上調的分子機制。 據報道，RNA 結合蛋白 （RBPS） 調節 circRNA 的產生。 圓環組分析和qPCR結果以及RIP驗證結果顯示EIF4A3 蛋白結合並促進 Circbirc6 的產生。
圖1 Circbirc6與奧沙利鉑耐藥性密切相關。
如前所述，CircBIRC6 富集於 CAF 而不是 NAF。 有趣，Circbirc6 也是 CAFS 的富集培養基（cm）而不是 NAFS（圖 2a-b）。 與NAF-CM共培養或單獨PDAC細胞相比，CAF-CM共培養PDAC細胞系中CircBIRC6水平顯著公升高提示 Circbirc6 可以遞送至 PDAC 細胞系中。細胞外Circbirc6研究發現，RNA處理對CAF-cm中Circbirc6水平不影響;用RNase和Triton X-100（透化溶液）聯合處理降低了CAF-cm中Circbirc6的水平（圖2C）。，表明 CircBirc6 可能存在於 CM 的 EV 中。此外，用毒蕈鹼鵝膏菌（CAF-CM共培養）處理PANC-1細胞可抑制內源性轉錄，並且不影響Panc-1細胞中Circbirc6的公升高（圖2D）。再次，有人建議EV-Circbirc6可以遞送至Panc-1細胞並富集。 總結一下技巧，EV-Circbirc6 富集於 CAF-CM 中，可遞送至腫瘤細胞中。
為了確認細胞外 Circbirc6 被包裹在 EV 中，作者從 CAF-CM 中分離出 EV。 Nanosight 和 WB 驗證了電動汽車的形態、大小和生物標誌物（圖 2E-G）。 EV中CircBIRC6的水平與CAF-CM中幾乎相同（圖2H）。這意味著 CircBIRC6 富集在 CAF 分泌的 EV 中，而不是直接釋放。 此外，血漿 EV 包封的 CircBiRC6 水平與配對的 CAF-EV-Circbirc6 水平呈正相關（圖 2i）。結果表明，血漿EV-Circbirc6主要來源於PDAC微環境中的CAF。
圖2 CAF-ev-circbirc6可以遞送至腫瘤細胞中。
為了探索CAF-CIRCBIRC6在體外對奧沙利鉑耐藥性的調控，作者首先在CAFS中分離出EVs，分別過表達和敲低CircbiRC6（圖3A-B）。隨後，PDAC細胞系與這些EV共同孵育。 結果顯示過表達 Circbirc6 的 CAF-EV 對奧沙利鉑表現出更高的半抑制濃度值和更高的細胞增殖**，而沉默 Circbirc6 則相反（圖 3c-f）。 此外，CAF-EV-circBIRC6 可減弱奧沙利鉑誘導的 PDAC 細胞凋亡並促進胰腺癌類器官增殖CAF-ev-SH-circbirc6 的情況正好相反（圖 3G-J）。 綜上所述，在離體研究中，CAF-EV-circbirc6可以正向調節奧沙利鉑耐藥性。
圖3 CAF-EV-circBIRC6可以正向調節奧沙利鉑耐藥性。
Circbirc6 通過 NHEJ 通路誘導奧沙利鉑耐藥
為了進一步闡明EV-CircBirc6驅動的奧沙利鉑耐藥機制，作者對CAF和敲除CircbiRC6的對照細胞進行了測序和KEGG分析，發現：DNA修復途徑的富集（圖 4a）。 雙鏈 DNA 斷裂（dsb）修復被認為是奧沙利鉑耐藥的關鍵機制之一。 隨後，作者使用中性彗星測定法（檢測DNA雙鏈斷裂損傷）來研究EV-CircBIRC6是否改變了PDAC細胞中DSB修復的效率。 結果表明，CAF-EV-CIRCBIRC6組的彗尾較短，H2AX水平降低，而CAF-EV-SH-CIRCBIRC6組則相反，表明CIRCBIRC6促進了DSB修復（圖4B-E）。 HR 和 NHEJ 是 DSB 修復的關鍵途徑。 CAF-EV-Circbirc6 提高了 NHEJ 的效率，但不能提高 HR（圖 4F-G）。 SCR7可以抑制NHEJ通路，實驗結果表明SCR7可以逆轉CAF-EV-circBIRC6促進腫瘤細胞增殖的作用H2AX分析結果是一致的（圖4H-I）。 綜上所述，結果表明：Circbirc6通過NHEJ通路介導奧沙利鉑耐藥性，阻斷NHEJ通路可消除CIRCBIRC6對奧沙利鉑耐藥性的影響。
圖4 Circbirc6通過NHEJ通路誘導奧沙利鉑耐藥。
確定CIRCBIRC6提高NHEJ修復效率的機制，作者還通過RNApulldown + MS+ WB + RIP測定確定CircBIRC6與Panc-1細胞中的XRC4結合（圖5A-E）。 Caf-ev-sh-circbirc6 不影響 Panc-1 細胞中的 XRCC4 mRNA 和蛋白質水平（圖 5F-G）。 竟然作者發現，CAF-EV-CIRCBIRC6增強了XRC4向染色質的募集（促進XRCC4核定位並提高NHEJ修復效率），而CAF-EV-SH-CIRCBIRC6則相反（圖 5h）。 接下來，作者合成了 CircBirc6 的分段探針，並確定 CircBirc6 的 400-600 nt 區域對 XRCC4 相互作用至關重要（圖 5i-j）。 非編碼RNA通常通過莖環結構與蛋白質相互作用。 我Circbirc6 （500-545） 形成雙鏈莖環結構該位點的突變也會損害將XRC4蛋白撕裂的Circbirc6的數量以及XrcC4核定位（圖5L-M）。
圖5 Circbirc6與XRCC4結合。
翻譯後修飾（PTM）在蛋白質定位中非常重要。 為了鑑定參與 XRCC4 核定位的關鍵 PTM，我們用 CAF-EV 和各種 PTM 抑制劑處理 PANC-1 細胞。 CAF-EV促進xrcc4核定位;抑制 SUMO 修飾 （2-D08） 抑制 XRCC4 核定位（圖 6a）。 Co-IP結果還證實，SH-circBIRC6顯著降低了修飾劑SUMO1與XRC4的連線，但沒有顯著改變XRC4的泛素化、磷酸化或甲基化（圖6B）。 這提示CircBirc6 影響 XRCC4 的 SUMO 修飾。Co-IP分析表明：，CircBIRC6 通過 SAE1 增強 XRCC4（相撲活酶）。相互 作用（圖 6c）。。Si-SAE1 減弱 SUMO1 對 XRC4 的修飾並抑制 XRC4 的核定位（圖 6D-E）。 考慮到修飾殘基在SUMO修飾對靶蛋白影響中的重要作用，我們使用GPS-SUMO（**SUMO修飾）在XRCC4上鑑定了兩個潛在的SUMO修飾位點（K115和K210）（圖6F-G）。 實驗表徵，K115R突變而非K210R突變顯著阻礙了XRC4的SUMO修飾和核定位（圖 6h-j）。 然後，作者研究了 SUMO 修飾依賴性 xrcc4 核定位是否是 EV-CircbiRC6 介導的奧沙利鉑耐藥所必需的。 結果是顯而易見的XRCC4 的 K115R 突變抵消了 EV-CircbiRC6 誘導的奧沙利鉑耐藥性（圖 6k）。 綜上所述，EV-Circbirc6 通過 SUMO 修飾途徑促進 xrcc4 核定位，從而促進奧沙利鉑耐藥性。
圖6 EV-Circbirc6通過SUMO修飾正向調控XRC4的核定位，促進奧沙利鉑耐藥。
為了研究EV-CircBIRC6在體內的作用，將XRCC4-WT或XRC4-mut轉導的PANN-1細胞注射到小鼠的胰尾中，並用奧沙利鉑和CAF-EV處理原位異種移植小鼠（圖7A）。 靜脈注射 CAF-EV-circBIRC6 導致化療反應差、腫瘤體積大、DSBS 水平降低和細胞凋亡，而 XRCC4 突變逆轉了這些作用並抑制了腫瘤生長（圖 7b-f）。
為了評估 CircbiRC6 XRCC4 軸的潛在價值，作者在臨床奧沙利鉑耐藥患者中建立了異種移植 （PDX） 小鼠模型，並使用靶向 CircbiRC6 的反義寡核苷酸 （ASO） 抑制劑進行檢測（圖 7G）。 不出所料AASO-circbirc6**顯著改善了化療反應。 此外，奧沙利鉑聯合ASO-circbirc6和奧拉帕尼可顯著改善化療反應（圖 7h）。 IHC分析顯示，ASO-circbirc6或ASOCIRCBIRC6與奧拉帕尼**聯合使用可增加DSBS水平和細胞凋亡（圖7i）。 綜上所述，Caf-ev-circbirc6 通過 SUMO 修飾途徑正向調控 XRC4 的核定位，促進奧沙利鉑耐藥性。
圖7 EV-circBIRC6誘導胰腺癌對奧沙利鉑的耐藥性。
為評估CIRCBIRC6對奧沙利鉑化療的反應價值和臨床意義，作者檢測了82例接受奧沙利鉑化療的晚期PDAC患者血漿EVs和原發腫瘤組織中CIRCBIRC6的表達，並通過免疫染色評估了H2AX中DNA損傷的水平。 結果顯示，與非耐藥組織相比，耐藥患者腫瘤組織中CircBIRC6水平公升高，H2AX水平降低（圖8A-C）。Circbirc6的表達與H2ax的表達呈負相關（圖8D）。作者還測量了SUMO修飾的XRCC4水平，發現耐藥患者腫瘤組織中XRCC4水平公升高，化療反應性減弱（圖8E-G）。 此外，與奧沙利鉑反應敏感的患者相比，耐藥患者的血漿 EV-circbirc6 水平公升高（圖 8h）。 Kaplan-Meier分析表明，血漿EV-CircBirC6含量越高，PFS越短（圖8i）。 然而，有趣的是，無論血漿EV-CircbirC6水平如何，接受其他無奧沙利鉑化療方案的患者的PFS均無顯著差異（圖8J）。 綜上所述，Circbirc6 可作為基於奧沙利鉑的化療耐藥性在胰腺癌中的潛在**和生物標誌物（圖 8k）。
圖8 Circbirc6與PDAC患者的DNA損傷和奧沙利鉑耐藥性相關。