中華人民共和國農業行業標準
ny/t 4307-2023
葛根中黃酮類化合物的測定
高效液相色譜法串聯質譜
determination of fl**onoids in the root of kudzu vine-
high performance liquid chromatography-mass spectrometry (hplc-ms)
前言
本檔案符合GB T 11-2020《標準化工作指南第1部分：標準化檔案的結構和起草規則》。
請注意，本文件的某些內容可能與專利有關。 本檔案的發布者不承擔識別專利的責任。
本檔案由農業農村部農產品質量安全監督司提出。
本檔案由農業農村部農產品營養標準專家委員會監督。
本檔案起草單位：北京工業大學、浙江省農業科學院、廣西壯族自治區農業科學院。
本檔案主要起草人：張芳、齊培培、王穎、王玉婷、支美麗、裴魯豫、李一山、閆華兵、尚曉紅。
範圍
本檔案規定了一種高效液相色譜-串聯質譜法定量檢測葛根中黃酮類化合物的方法。
本檔案適用於葛根素，3'- 羥基葛根素，3'- 測定11種黃酮類化合物，包括甲氧基葛根苷元、黃豆苷元、黃豆苷元、染料木黃酮、毒刺黃精、花青素、異甘草甜素和鷹嘴豆芽A。
規範性參考文獻
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GB T 6682 分析實驗室用水規範和風險試驗方法。
術語和定義
本文件中沒有需要定義的術語和定義。
原則
採用乙醇水溶液超聲提取葛根樣品中的黃酮，採用高效液相色譜-串聯質譜法測定，外標法定量。
試劑和材料
除非另有說明，否則所有試劑均為分析純度。
5.1 試劑。
5.1.1 水：GB T 6682,1 級。
5.1.2甲醇（CH40）：色譜純。
5.1.3甲酸（CH2O2）：色譜純。
5.1.4乙醇（C2H6O）：分析純。
5.2.試劑製備。
5.2.1 10%甲醇溶液：取10ml，甲醇（5.）1.2）、加水（5.）1.1） 將體積設定為 100 毫公升並充分混合。
5.2.2 30%乙醇溶液：取30ml，乙醇（5.）1. 4).加水 （5.）1.1） 將體積設定為 100 毫公升並充分混合。
5.3個標準。
黃酮標準品：相關資料見表1，純度不低於98%。
5.4.標準溶液的配製。
5.4.1.黃酮標準貯備液：精密稱取11種（表1）待測物質的標準品，用甲醇（51.2）溶解後，加入10%甲醇溶液（52.1）定量稀釋製成高濃度單標儲備液。將一定量的 11 種單一標準儲備溶液移液到 25 ml 容量瓶中，加入 10% 甲醇溶液 （52.1）定容，製成10mg l母液作為標準儲備液。防止 light-18 並保留以備後用。
5.4.2.黃酮混合標準溶液：與10%甲醇溶液（52.1：母液10mgl（54.1）稀釋配製不同濃度的混合標準溶液，繪製標準曲線。應使用混合標準溶液並配製。
儀器裝置
6.1 超高效液相色譜-串聯質譜儀：配備電噴霧離子源（ESI）。
6.2、電鼓風乾燥箱：溫度50°C330，功率3°C1 kw。
6.3 超聲波清洗機：超聲波輸入功率 200 W。
6.4.離心機：轉速不低於7 500轉分。
6.5、超細水冷破碎機：細度20目180目（085mm~0.09mm），功率 25kw。
6.6 平衡：電感 0001 g 和 0000 1 go
試樣製備
7.1.試樣製備。
將新鮮葛根洗淨除去沉澱物，去皮，用切片機切成2公釐的薄片，放入托盤中，在70度的烤箱中乾燥至恒重。 然後，葛根樣品在分級超細水冷研磨機中粉碎，並將其全部包裝到乾淨的容器中，以便立即進行測試。 如果需要更長的儲存時間，請密封並標記樣品並將其儲存在 -18 以下。
7.2 標本提取。
稱重 05 g （精確到 0.）000 1g），置於50ml離心管中，加入25ml 30%乙醇溶液（52.2）室溫下超聲提取45分鐘。 以7500r分鐘離心5分鐘，並將上清液轉移到50ml容量瓶中。 然後用30%乙醇溶液（52.2）洗滌2次，每次用量約5毫公升。 在相同條件下離心5分鐘，合併上清液，30%乙醇溶液（52.2） 大小為 50 毫公升。 載入前，022 m 有機相過濾膜過濾 （5.）5)。
測定
8.1 超高效液相色譜參考條件。
8.1.1 根色譜柱：ACE Excel C18 色譜柱 （100 mm2.）1mm×1.7 m） 或同等水平。
8.1.2.流動相A：甲醇（5.）1.2)。
8.1.3流動相B：01%甲酸水溶液，取01毫公升甲酸（5.）1.3） 加水 （5.）1.1） 將體積設定為 100 毫公升並充分混合。
8.1.4、柱溫：40°C。
8. 1.5 流量：03 ml/min。
8.1.6. 注射量： 10 l.
8.1.7 流動相：梯度洗脫過程如表2所示。
8.2質譜參考條件。
8.2.1、掃瞄方式：正負離子掃瞄。
8.2.2電離電壓：4 000 V。
8.2.3、毛細管溫度：250°C。
8.2.4、碰撞氣體：氬氣（純度99.）99%），壓力為270 kPa。
8.2.5、霧化氣體：氮氣（純度97%以上），流量3 0 l/min。
8.2.6.輔助氣體：氮氣（純度97%以上），流量100 l/min。
8.2.7、檢測方式：多反應監測（MRM）。
8.2.8.黃酮保留時間和監測離子對資訊見附錄A
3.3.測試樣品的測定。
在儀器的最佳條件下，將黃酮類化合物與標準溶液（54.2）用葛根素等11種黃酮樣品（72）在機器上測量。混合標準溶液中11種黃酮類化合物的總離子色譜圖和各組隔膜的色譜圖見附錄A。
8.4. 定性測量。
如果樣品溶液中檢測到的峰的保留時間與基質標準溶液中目標色譜峰的保留時間一致（變異範圍為2.），則在相同的測試條件下測定樣品和混合標準品。5%），將樣品溶液的質譜離子對相對豐度與相同程度的基質標準溶液質譜離子對的相對豐度進行比較，相對離子豐度的相對偏差不超過表3規定的範圍，即可確定樣品中是否存在該組分。混合標準溶液中各黃酮類化合物的離子色譜圖見附錄B。
8.5.定量測量。
以不同濃度的混合標準溶液濃度為橫坐標，以色譜峰面積（響應值）為縱坐標，繪製標準曲線，標準曲線相關係數應不小於099。樣品溶液和標準溶液中分析物的響應值應在儀器的線性範圍內。 如果超過線性範圍，則應相應稀釋樣品溶液和基質匹配的混合標準系列溶液並重新測量。 在單點校準定量中，樣品溶液中分析物的濃度與溶劑混合標準溶液的濃度相差不超過30%。 標準新增法以新增標準溶液的濃度為橫坐標，色譜峰面積（響應值）為縱坐標，繪製標準曲線，外推至濃度軸。
8.6 結果計算。
採用液相色譜質譜資料處理軟體或按公式計算試樣中檢測目標的量，按公式（1）計算。
其中： - 樣品中黃酮類化合物含量的值，單位為毫克/千克（mg kg）;
a——樣品中黃酮類化合物的峰面積;
s - 標準溶液的濃度值，單位為毫克/公升（mg l）;
v - 固定體積的體積值，單位為毫公升（ml）;
f——稀釋因子;
AS—標準品中黃酮類化合物的峰面積;
m – 最終溶液所表示的試樣質量的數值，單位為克 （g）。
注：空白值應從計算結果中減去，測量結果表示為平行測量的算術平均值，保留3位有效數字。
精度
9.1 重複性。
在重複性條件下獲得的 2 次獨立測量結果之間的絕對差異不大於 2 次測量的算術平均值的 15%。
9.2 再現性。
在重現性條件下獲得的 2 次獨立測量結果之間的絕對差異大於 2 次測量的算術平均值的 15%。
檢測限和定量限
黃豆苷元，葛根素，3'- 甲氧基葛根素和花青素的檢出限為001mg kg，定量限為003 mg/kg；秸稈稈，3'- 甲氧基葛根素和異甘草甜素最容易被檢測到02mg kg，定量限為007 mg/kg；黃豆苷元、染料木黃酮、染料木黃酮和鷹嘴豆A的檢出限為003mg kg，定量限為01 mg/kg。
*從：