抗體藥物因其高特異性、顯著的療效和優越的藥代動力學而在生物製藥市場中發揮著重要作用。 根據 Frost & Sullivan** 的資料，到 2030 年，全球抗體藥物市場預計將增長到 4431 億美元。 隨著抗體藥物需求的逐步擴大，抗體發現和篩選技術的發展勢在必行。 目前，抗體技術最常見的應用包括雜交瘤技術、噬菌體展示技術和B細胞轉殖技術。 每種技術都有自己的優點，在本期中，我們將重點介紹單B細胞抗體技術。
單細胞抗體技術是指利用乙個B細胞中只含有乙個功能性重鏈可變區DNA序列和乙個輕鏈可變區DNA序列，而乙個B細胞只產生一種特異性抗體特徵，從免疫動物組織或外周血中分離出特異性B細胞，然後通過單細胞PCR技術從B細胞中分泌出單抗體，擴增重鏈可變區和輕鏈可變區區域DNA序列，最後在哺乳動物細胞中表達，獲得具有生物活性的單轉殖抗體。目前，單B細胞抗體技術已廣泛應用於病原微生物感染、腫瘤、自身免疫性疾病和器官移植等領域，並顯示出獨特的優勢和良好的應用前景。
傳統的雜交瘤抗體具有較長的發育週期，包括免疫接種，通常需要8個月左右。 而且，由於雜交瘤融合率的限制，整個B細胞群中只有一小部分B細胞完全融合，獲得的陽性轉殖很少，不適合對大型抗體庫進行綜合篩選。 對於噬菌體展示技術來說，儘管其文庫容量很大，但重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL）的配對通常依賴於隨機組合，而大部分形成是非自然的VH-VL抗體配對。 單B細胞抗體技術作為繼雜交瘤技術和噬菌體展示技術之後的新一代抗體開發技術，具有開發周期長、陽性轉殖多、全源源、細胞體積小等優點。 最重要的是，通過單細胞抗體技術獲得的抗體確保了輕鏈和重鏈的自然配對，這在抗體開發中至關重要。
單B細胞抗體技術全過程主要有五個步驟，包括B細胞富集、單B細胞篩選、抗體基因測序分析、重組抗體表達、抗體功能驗證等。
figure 1. the process of single b cell antibody technology
B細胞富集，B細胞一般**在外周血中，B細胞可通過靜脈採血和離心分離白細胞層獲得。
單B細胞篩選，也稱為單B細胞分離或陽性轉殖篩選，是指從混合B細胞群中分離出單B細胞，是單B細胞技術中最關鍵的步驟。 根據樣品型別，單B細胞分離可分為隨機分離和抗原特異性分離。 隨機分離是指B細胞的分離，常用的分離方法包括顯微操作、雷射捕獲顯微切片和螢光啟用細胞分選。 這種型別的分離適用於具有高濃度抗原特異性抗體的樣本（例如，來自疫苗接種者或患者的血液樣本）。 抗原特異性分離是指抗原特異性B細胞的分離，常用的分離方法包括螢光標記抗原多引數細胞組分、抗原標記磁珠分選、微雕法、細胞微陣列等。 這種型別的分離適用於抗腫瘤抗體和自身免疫抗體等特異性抗體含量較低的情況。
獲得單個B細胞後，對其抗體基因進行測序和分析。 如前所述，此步驟可以通過單細胞PCR技術來擴增重鏈和輕鏈可變區DNA序列，然後進行測序。 測序後，可以通過生物資訊學對測序資料進行分析，包括基因序列比對、突變鑑定和親和力評估。
通過上一步對抗體基因的測序分析，通常選擇親和力較好的抗體基因進行重組抗體表達。 具體選擇需要根據您自己的實驗設計。 在生物製藥研究領域，常用用於重組抗體表達的表達系統是哺乳動物細胞表達系統。
抗體基因重組表達後，需要進一步驗證其功能，以確定其生物活性和抗原結合能力，常用的驗證方法包括流式細胞術、酶聯免疫吸附劑和免疫組化。
基於單B細胞技術的創新兔單轉殖抗體發現平台，專注於轉殖抗體基因前的單B細胞體外培養。 與傳統的單細胞PCR相比，Dima轉殖的數百個B細胞的抗體基因來源於單個親本B細胞。 這種方法顯著提高了轉殖的成功率，使Dymad能夠從免疫動物身上獲得更多的陽性先導抗體序列。 正常情況下，乙隻兔子的B細胞總數可以達到3-5x10 8，從中獲得的分泌特異性抗體B細胞轉殖總數可以達到數萬個。 平台利用兔單轉殖抗體的優勢，提供從抗原合成到抗體功能驗證的一站式服務，時間短，可直接獲取抗體基因序列和功能蛋白抗原。
平台流程
figure 2. the process of dimab® platform
個案研究
BCMA先導抗體分子開發與CAR-T應用。
GPRC5D先導抗體分子開發及CAR-T應用。
此外，針對熱門藥物靶點，迪馬還準備了B細胞種子庫。 DIMAB B 細胞種子庫由從免疫兔中分離的 B 細胞構建而成，這些 B 細胞已通過 ELISA 和 FACS 預先驗證，可特異性結合抗原蛋白。 DIMAB B 細胞庫主要用於篩選先導抗體分子。 篩選出的先導分子具有多樣的CDR序列和良好的成藥性。 目前對應種子庫有靶點，最快35天即可獲得先導抗體。 截至2023年底，近五年來，電馬已完成407個新靶點B細胞種子庫的製備和275個藥物靶點先導抗體分子的開發。 除了兔單轉殖抗體，迪馬還搭建了鼠單轉殖抗體、綿羊單轉殖抗體和奈米抗體的開發平台。