在上一期《走進科學，走進基因突變》一文中，小藝帶大家了解了基因突變的簡單知識，相信大家對基因突變都有一定的了解。 作為當今生命科學的研究熱點之一，檢測方法也得到了快速發展，基因突變的檢測可以促進疾病的早期診斷和**。 下面簡要介紹幾種常用的基因突變檢測方法及其基本原理，可根據試驗目的和實驗條件選擇參考。
一southern blot科技
Southern 印跡由英國生物學家 Edwin Southern 於 1975 年發明，並命名為 Southern 印跡，以紀念該技術的誕生。 該技術是最早出現的印跡技術，是分子生物學領域最常用的DNA檢測方法之一。 其基本原理是，在一定條件下，根據鹼基互補的原理，可以特異性地雜交具有一定同源性的兩個核酸單鏈形成雙鏈。 如果樣品包含與探針互補的序列，則通過鹼基互補原理將兩者結合，然後用自成像或其他適當技術清洗和檢測游離探針，以揭示待測片段及其相對大小（圖1）。 因此，該技術成為探針雜交領域最經典的分子檢測方法，並已廣泛應用於各種基因突變和限制性片段長度多型性（RFLP）的鑑定。 有關Southern Blot的更多資訊，請參閱實驗技術“四大發明”中的文章“Approaching the Southern Blot， Northern Blot， and Western Blot”。
圖1 Southern Blot工藝示意圖（**來源：國家人類基因組研究所）。
第二PCR技術
對於基因突變的檢測，在1985年之前，主要使用Southern Blot，它可以篩查基因缺失、插入和移碼重組等多種突變。 由於當時無法人工擴增樣本中的靶基因，那些無法通過Southern印跡檢測的突變只能通過誘變引物的複雜DNA測序分析來確定，以在體外建立寡核苷酸介導的DNA突變，但這種方法不僅複雜，而且耗時長。 費力，成本高昂。隨著聚合酶鏈式反應（PCR）技術的興起，幾乎所有用於基因突變檢測的分子診斷技術都基於PCR，其自動化程度、分析時間和結果準確性都得到了進一步提高，PCR技術的出現是基因突變檢測研究的一大進展。 下面小藝將介紹臨床實踐中幾種常用的基因突變檢測技術的原理。
1、arms-pcr擴增難治性突變系統 PCR （ARMS-PCR），也稱為等位基因特異性 PCR （AS-PCR），基於等位基因特異性延伸反應，只有當等位基因特異性引物的 3' 端與突變位點鹼基互補時才能進行。 ARMS-PCR已成為全球腫瘤個體化分子檢測最重要、最先進的技術之一，也是診斷遺傳病最準確的技術工具之一。
ARMS-PCR與普通PCR的區別在於，等位基因的兩個上游引物的3'末端序列在引物設計時不同，在進行PCR擴增時，不能與模板完全匹配的上游引物將無法與模板完全形成互補鹼基對， 形成錯配，當錯配達到一定水平時，引物延伸將被終止，並且不會獲得特定長度的PCR擴增產物，從而表明模板DNA沒有與引物的3'端配對的鹼基，反之亦然（Peng et al. 2018）。目前，科學家已將Tetra-primer Arms-PCR方法擴充套件為同時設計四種PCR引物，其中兩種位於3'SNP位點，方向相反，屬於不同基因型，另外兩種位於SNP的外部（圖2）。
圖2 四引物ARMS-PCR方法示意圖（Ye et al.）。, 2001）。不同的顏色表示參與PCR反應的不同引物。
2. 數字PCR數字PCR（DPCR）是核酸分子的絕對定量技術，即第三代PCR技術，是生命科學和醫學診斷的關鍵技術之一。 1999年，Bert Vogelstein和Kenneth WKin-Zler正式提出了數字PCR的概念。 當液滴中的靶標通過PCR擴增時，擴增完成後對各反應單元的螢光訊號進行統計分析，螢光訊號為1，無螢光訊號為0，以獲得供試樣品中突變體和野生型的絕對定量，可檢測到低至一拷貝的突變（圖3）。
圖3 典型的數字PCR工作流程方案（CAO et al.）, 2020）。
HRM高解像度熔解曲線分析技術
高解像度熔解曲線（HRM）由猶他大學分子病理學教授Carl Wittwer發明，是一種基於PCR技術的技術，用於檢測和分型靶片段的基因變異。 HRM主要依靠含有飽和DNA雙鏈螢光染料的PCR靶標片段、優化的靶標片段設計、能夠有效控制溫度獲得高解像度熔解曲線訊號的儀器系統、熔解曲線軟體分析系統。 該技術因其操作簡單、檢測成本低、速度快、PCR後無需開管、避免二次汙染的機會、檢測靈敏度高等特點，在醫學等生物相關科學的各種基因檢測中得到了迅速推廣和應用。
HRM的主要原理是利用可插入PCR產物的飽和雙鏈DNA（dsDNA）染料的特性，通過實時監測加熱過程中DSDNA熔解、螢光染料脫落、螢光訊號減弱或消失的過程，並以高解像度記錄熔解曲線，從而對單個鹼基進行高解像度的解析， 以及樣本突變、SNP 和甲基化位點的高靈敏度分析。
圖4 HRM原理檢測等位基因表達失衡示意圖（Nguyen-Dumont等）。, 2011）。
與其他檢測基因突變的方法一樣，HRM技術也存在一定的侷限性，例如難以識別未知突變位點，並且檢測靈敏度受檢測到的基因片段的SNVS型別的影響。 然而，該技術的優勢正好符合當前個體靶向分子診斷的需求。 該技術不僅像其他以靶基因片段為檢測靶點的基因檢測方法一樣具有靈活性、快速性、靈敏度高、成本低等優點，而且可以實現所有基因變異型別的檢測，並能靈活地提高檢測通量，節省檢測樣本量、檢測時間和成本， 並降低汙染風險，以滿足臨床測試的需要。
4.等溫放大技術與傳統PCR相比，它不需要熱迴圈儀器，具有快速靈敏、簡單便攜、特異性強等優點，在分子診斷方面具有很好的應用前景，特別是在床旁檢測和現場篩查方面。 其基本原理是利用雜鏈取代酶、聚合酶、RNA切割酶等多種酶，基於環狀DNA擴增機理，在恆溫條件下完成DNA擴增過程。 在等溫擴增過程中，通過設計合適的引物，可以在RNA剪下酶的作用下生成不同長度的RN**片段。 通過檢測這些RN**片段，可以分析DNA序列中的特定突變（Boonbanjong等人, 2022）。
圖5 PCR和一些IAT系統的示意圖（Boonbanjong等人）。, 2022）。
隨著生物科學和技術的發展，IAT衍生出多種技術，如環介導的等溫擴增（LAMP）、滾環擴增（RCA）和基於核酸序列的擴增（NASBA）、解旋酶依賴性等溫DNA擴增（HDA）、重組酶聚合酶擴增（RPA）、切口酶擴增（近）、鏈置換擴增（SDA）、雜交鏈式反應（HCR）等技術， 由於篇幅有限，本文不再詳細講解各種技術的原理和應用，對IAT感興趣的同學可以查閱相關資料進行學習。
有關PCR技術的更多資訊，請參閱“您真的可以區分PCR，QPCR，RT-PCR，RT-QPCR和實時螢光定量PCR嗎？ 品。
3.基因測序方法
基因測序的本質是利用基因測序儀確定基因上四個鹼基（a、t、g、c）的順序，具體原理是用不同顏色的螢光標記基因中的四個鹼基，利用基因測序儀中的雷射系統，按照鹼基排列的順序依次激發鹼基發出螢光， 不同型別的螢光顏色不同，使用特殊的相機來捕獲螢光訊號，以確定基因上鹼基的順序。隨著科學技術的進步，基因測序已經從第一代測序發展到後來的第二代測序（NGS），再到現在的第三代測序（TGS）。
1. 第一代測序1977年，桑格和吉爾伯特分別提出了雙脫氧鏈終止法和化學降解法，標誌著第一代測序技術的誕生。 其中，桑格雙脫氧鏈終止法（即桑格測序）是最經典的第一代測序技術之一，也是應用最廣泛的基因突變檢測方法之一，而化學降解法則逐漸被遺忘。 Sanger 測序通過用特異性引物靶向模板 DNA 的特定區域，將雙脫氧核苷酸 DDNTP 新增到 PCR 反應中，通過電泳分離細長產物，並檢測螢光標記以獲得每個位置的鹼基資訊來分析 DNA 序列中的特定突變（圖 6）。 作為測序的“金標準”，Sanger測序比NGS和TGS具有更高的測序準確度，700-1000bp讀長的準確度高，可以很好地處理重複。 缺點是一次只能檢測到乙個模板，速度慢且耗時（Zhang et al.）。, 2021）。
圖6 Sanger測序過程（Zhang et al.）, 2021）。
2. 二代測序二代測序（NGS）是基於PCR技術和基因晶元，採用大規模並行測序技術，可以合成具有數百萬條互補鏈的測序模板，同時獲得序列資料。 NGS主要採用隨合成測序（SBS）技術和邊緣連線測序（SBL）技術。 目前，Illumina測序系統已成為NGS的主流。 NGS通過捕獲DNA複製過程中新新增的鹼基攜帶的特殊標記物（通常是螢光分子標記物）來確定DNA的序列，整個過程可分為四個主要步驟：文庫製備、DNA簇生成、邊合成邊測序和資料分析。 NGS具有高通量和短讀長兩個重要特點，其高效率和低成本的單鹼基測序為臨床應用提供了不可估量的優勢。
3. 三代測序三代測序（TGS），又稱從頭測序技術，是測序技術的乙個里程碑，是在單分子測序（SMS）和大規模平行測序技術的基礎上開發新技術。TGS主要包括Pacbio技術和Nano Pore技術（Athanasopoulou et al.）。, 2021）。例如，在奈米孔系統的情況下，奈米孔蛋白被固定在電阻膜上，當核酸通過奈米孔時，這會導致電荷發生變化。 由於奈米孔的直徑非常小，只允許單個核酸聚合物通過，不同的鹼基在通過蛋白質奈米孔時會干擾電流，並且可以通過實時監測和解碼這些電流訊號來確定鹼基序列。 TGS具有測序讀長、原始DNA樣品直接測序、RNA和甲基化DNA序列直接檢測、操作快等優點。
四、雜交法
螢光原位雜交
1986年，科研人員開始利用異硫氰酸螢光素標記探針，並在螢光顯微鏡下觀察分析，建立了螢光原位雜交（FISH），即根據鹼基互補配對的原理，將外源核酸（即分子探針）與DNA或RNA配對，在組織和細胞上進行檢測，形成核酸雜交分子。 用報告分子（例如生物素、地高辛）標記核酸探針的核苷酸，可以利用報告分子與螢光素標記的特異性親和素之間的化學反應，使探針訊號被螢光顯微鏡捕獲，以分析待測樣品中是否存在基因突變。
2.基因晶元基因晶元技術是90年代中期以來發展迅速的高科技分子生物學技術，是一門融合了各學科的新興科學，目前主要應用於疾病診斷和藥物研究。 其主要原理是通過與一組已知序列的核酸探針雜交來確定核酸序列的方法，並將具有已知目標核苷酸序列的探針固定在底物表面。 當溶液中帶有螢光標記的核酸序列tatgcaatctag與基因晶元上相應位置的核酸探針匹配時，通過確定螢光強度最強的探針位置，可以得到一組序列完全互補的探針序列，並可以重新組合目標核酸的序列。
引用
athanasopoulou k, boti m a, adamopoulos p g, et al. third-generation sequencing: the spearhead towards the radical transformation of modern genomics[j]. life, 2021, 12(1): 30.
boonbanjong p, treerattrakoon k, waiwinya w, et al. isothermal amplification technology for disease diagnosis[j]. biosensors, 2022, 12(9): 677.
cao y, yu m, dong g, et al. digital pcr as an emerging tool for monitoring of microbial biodegradation[j]. molecules, 2020, 25(3): 706.
nguyen-dumont t, jordheim l p, michelon j, et al. detecting differential allelic expression using high-resolution melting curve analysis: application to the breast cancer susceptibility gene chek2[j]. bmc medical genomics, 2011, 4: 1-10.
peng b, wang q, luo y, et al. a novel and quick pcr-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice)[j]. acta pharmacologica sinica, 2018, 39(1): 117-123.
ye s, dhillon s, ke x, et al. an efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms[j]. nucleic acids research, 2001, 29(17): e88-e88.
zhang l, chen f x, zeng z, et al. advances in metagenomics and its application in environmental microorganisms[j]. frontiers in microbiology, 2021, 12: 766364.