後生元功能及應用研究進展
總結：後生元是指為宿主帶來健康益處的無生命微生物或其成分的製劑，是微生態製劑領域的乙個新興概念。 後生元具有平衡腸道菌群、增強腸上皮屏障功能、增強免疫調節、促進新陳代謝等多種作用，具有穩定性高、安全性高、易儲存等優點，使其在食品、保健品、化妝品、飼料等領域具有廣闊的應用前景。 目前，後生元的研究、開發和應用仍處於起步階段，在明確有效成分和用量、明確作用機理和靶點、制定相應法規和標準等方面仍需更深入的探索。 本文闡述了後生元的功能特點、製備方法、鑑定方法及市場應用，為後生元的研究、開發和應用提供參考。
關鍵字：後生元; 益生菌; 益生菌功能; 作用機制; 工業應用。
聯合國糧食及農業組織和世界衛生組織的提議益生菌; 定義：攝入足夠量的活微生物對宿主的健康有益。在過去的幾十年裡，益生菌在改善人類健康以及動植物生長和健康方面的作用已被眾多研究證實。 隨著研究的深入，越來越多的研究發現，益生菌的死菌及其代謝產物還具有多種功能活性，可以刺激組織發育，影響機體的營養水平和生理功能。 Tsilingiri等人首次將這種無生命的死細菌及其成分稱為“後生元”。 2021年，國際益生菌和益生元科學協會發布了乙份關於全球後生元的共識宣告，將：後生元; 定義為具有明確遺傳背景的滅活微生物和/或細菌成分，無論是否具有代謝物
後生元具有多種功能特性，包括抗氧化、抗炎、抗癌、平衡腸道菌群、增強腸上皮屏障功能、增強免疫調節和促進新陳代謝。 除了上述功能外，後生元與益生菌相比還有幾個優點：一是它們更穩定，保質期更長，環境耐受性更好; 其次，它更安全，更適合一些特殊人群，如新生兒和敏感人群。 後生元也不受抗生素干擾的抑制，不存在傳遞抗性基因的風險; 第三，它的目標範圍更廣; 第四，後生元中的活性物質更容易被腸道吸收，提高利用率; 第五，後生元的靶點範圍更廣，不僅限於腸道，還包括口腔、泌尿生殖道或鼻咽部。 因此，後生元應用範圍廣泛，可應用於食品、保健品、化妝品、飼料、植物營養等多個行業，具有廣闊的市場應用前景。
後生元功能概述
後生元主要分為兩部分：細菌成分和細菌代謝產物。 其中，細菌成分主要包括肽聚醣、磷壁酸、甘草酸、縮醛磷脂、膜蛋白和細胞內多醣。 細菌代謝產物包括維生素、脂類、有機酸、細菌素、酶、胞外多醣、短鏈脂肪酸等，其複合物組成也決定了其功能的多樣性，大量的體內實驗和體外實驗（表1）證實了後生元功能的多樣性。
表1後生元的體外和體外實驗
table 1 in vivo and in vitro experiments of postbiotics
1.1.平衡腸道菌群
腸道菌群與宿主健康之間存在互動關係，後生元可以通過改善腸道菌群來促進宿主健康。 在一項隨機、雙盲平行臨床試驗中，口服巴氏殺菌乳桿菌CP2305與安慰劑組相比，顯著改善了實驗組成員的焦慮和睡眠障礙，糞便菌群分析發現，實驗組腸道雙歧桿菌含量顯著增加，但作用的具體機制尚不清楚，需要進一步研究。 Kimoto-Nira等[13]發現，口服熱滅活乳球菌G50可刺激免疫球蛋白A的分泌，增強腸道免疫力，抑制有害細菌的增殖。 在一項對後生元**2型糖尿病大鼠模型的研究中，熱滅活的嗜熱鏈球菌不僅降低了空腹血糖水平，降低了葡萄糖耐量和胰島素抵抗，還有效地增加了瘤胃球菌和Velon cocci等有益菌的豐度。 Izuddin等報道了後生元對斷奶羔羊的益生菌作用，結果表明，服用植物乳桿菌RG14游離上清液可增加琥珀酸桿菌和黃原菌的數量，減少產甲烷菌的數量，提高宿主的養分攝入和養分消化率，減輕斷奶應激對羔羊生長的不利影響。 此外，一項體外實驗表明，乳酸菌和雙歧桿菌16株菌株的無菌上清液可以減少腸侵襲性大腸桿菌對T84和CaCO2細胞的侵襲，結果表明，這些無細胞上清液可以阻止EIEC侵入腸道細胞，但作用機制仍有待進一步探索。 腸道菌群與宿主之間存在多種訊號傳導系統，後生元可以改善腸道菌群的結構，預防和輔助各種疾病，如慢性肝病、結核病等。 鑑於後生元的安全特性，它們平衡腸道微生物群的功能有望用於幫助新生兒建立健全和有益的腸道微生物群。 1.2.增強腸上皮屏障功能
腸上皮細胞是腸道的第一道防線，不僅作為物理屏障，還與宿主免疫系統相互作用，限制有害物質和微生物向身體其他部位的遷移。 後生元中的各種成分可以修復或增強腸上皮屏障功能。 Gao等發現鼠李糖乳酪桿菌（Lacticaseibacillus Rhamnosus GG，LGG）發酵上清液可促進幼小鼠腸道屏障的形成，從發酵上清液中純化出分泌蛋白HM0539，證明其對腸道屏障有較強的保護作用，表現為促進腸粘液蛋白的表達，防止脂多醣或腫瘤壞死因子誘導腸道屏障損傷。這表明這種發酵的上清液可能有助於新生兒腸道屏障的形成。可溶性蛋白P40也是鼠李糖乳桿菌GG的代謝產物，功能分析表明，P40能抑制腸上皮細胞凋亡，促進腸上皮細胞粘蛋白的產生，通過上調腸上皮細胞中增殖誘導配體的表達來促進IgA的產生，從而改善腸損傷和結腸炎。 p40的訊號轉導機制主要是啟用解整合素-金屬蛋白酶17並釋放肝素結合的表皮生長因子，進而啟用腸上皮細胞中的表皮生長因子受體，從而刺激多種下游訊號通路，如原活化蛋白激酶訊號通路，進而誘導細胞增殖、分化、 遷徙和生存。上野等發現，熱滅活短乳桿菌SBC8803可提高葡聚醣硫酸鈉誘導的結腸炎小鼠的存活率，進一步研究發現，SBC8803熱滅活短乳桿菌通過誘導熱休克蛋白、啟用絲裂原活化蛋白激酶P38（P38 MAPK）通路、調節腫瘤壞死因子白細胞介素-1和白細胞介素-12的表達，增強腸道屏障功能， 從而改善結腸炎小鼠模型的腸道損傷。後生元具有與活益生菌相似的益生菌作用，並且更安全，並且在不適合活益生菌的條件下，後生元是預防和發展炎症性腸病的有效且潛在的選擇。
1.3 增強免疫調節
後生元還可以通過增強身體的免疫調節功能，尤其是腸道免疫力來改善身體的健康。 腸道是人體最大的免疫器官，約佔人體免疫系統的70%，後生元通過腸道調節宿主免疫系統，從而提高人體的免疫力。 Martorell等人發現，失活的長雙歧桿菌保留了抵抗氧化應激損傷的能力，同時它還通過啟用與先天免疫功能相關的途徑來減少急性炎症反應和腸道屏障破壞，並抑制有害細菌的定植。 通過體外實驗，研究人員證明，嗜酸乳桿菌和乾酪乳桿菌的上清液可以減少TNF-的分泌，增加抗炎因子白細胞介素-10的分泌，從而達到抗炎作用。 De Marco等發現，嗜酸乳桿菌、乾酪乳桿菌、乳酸乳球菌、羅伊氏乳桿菌和布氏酵母等游離上清液可下調結腸上皮HT-29細胞中前列腺素E2和IL-8的表達，並調節巨噬細胞IL-1、白細胞介素-6、TNF-和IL-10的表達，具有獨特的抗炎活性。 還發現，熱滅活的加氏乳桿菌TMC0356比活的加氏乳桿菌TMC0356具有更好的免疫調節功能，這表現為熱滅活的加氏乳桿菌TMC0356可以誘導巨噬細胞產生更多的IL-12，對N-乙醯壁醯胺酶具有更強的抗性。 在離體器官模型實驗中，乾酪乳桿菌DG發酵上清液能夠降低腹瀉性腸易激症候群患者迴腸和結腸粘膜中白細胞介素-1、IL-6和白細胞介素-8的水平，並增加IL-10 mRNA的水平，從而降低迴腸和結腸粘膜的炎症反應。 在小鼠模型中的一項實驗發現，熱滅活的植物乳桿菌B240可以通過刺激IgA分泌來有效保護宿主免受鼠傷寒沙門氏菌的侵害。 同樣，熱滅活的副乾酪乳桿菌MCC1849可誘導腸道組織中Ig+細胞分泌免疫球蛋白（IgA），影響腸道集合淋巴結中濾泡輔助性T細胞的產生，從而刺激宿主的獲得性免疫反應。 研究表明，後生元免疫調節的功能特性有助於 COVID-19 患者的佐劑和陽極。
1.4.促進新陳代謝
後生元調節人體新陳代謝的方式包括直接調節活性物質進入人體迴圈系統，以及通過調節腸道菌群進行間接調節。 臨床實驗表明，後生元對多種代謝性疾病有輔助作用。 Lee等發現，定期口服植物乳桿菌L-14裂解物可在脂肪細胞分化初期刺激腺苷酸活化蛋白激酶訊號通路，抑制脂肪前體細胞3T3-L1和人骨髓間充質幹細胞分化為成熟脂肪細胞，控制小鼠體重增加和脂質分布。肥胖和代謝紊亂。Montazeri-Najafabady等研究了5種益生菌（嗜酸乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、乾酪乳桿菌、長雙歧桿菌和凝結芽孢桿菌）的細胞裂解物和上清液對卵巢切除大鼠的影響，結果表明，多種後生元顯著提高了宿主全身骨礦物質密度，其中乾酪乳桿菌上清液顯著提高了脊柱的BMD， 乾酪乳桿菌和凝結芽孢桿菌的裂解物和上清液，長雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的裂解物顯著增強股骨BMD;雖然後生元不能顯著提高血清鈣濃度，但可以提高宿主的鈣吸收率，因此具有用於改善女性絕經後骨質疏鬆症的潛力。 此外，ADR-159（熱滅活發酵乳桿菌和德氏乳桿菌共培養發酵液）顯著降低雄性小鼠的皮質酮水平並改變神經代謝物水平，從而緩解抑鬱症狀。 Humam等發現，植物乳桿菌RI11的游離上清液可以提高抗氧化酶的活性，上調IL-10的mRNA表達，下調IL-8、TNF-、熱休克蛋白70和酸性醣蛋白的水平，因此RI11有望作為抗生素的替代品，減少熱應激對肉雞的不良影響。 此外，研究發現，在飼料中新增後生元可以改善兔子的新陳代謝狀態，提高其品質。 基於後生元的功能特性和安全性，有望成為一類新的、安全的飼料新增劑。
1.5 其他
後生元除了對宿主健康具有多種作用外，在食品貯藏、食品包裝和生物膜控制方面也有很好的應用前景。 由於後生元對溫度、氧氣等環境具有很高的耐受性，因此對運輸和儲存條件沒有限制，這使得它們在食品工業中的應用更加廣泛。 在食品中加入後生元，不僅增加了食品的益生元功能，而且抑制了病原菌，起到了防腐作用，從而達到“多效融合”。 後生元的防腐作用主要與其成分中所含的細菌素、胞外多醣、短鏈脂肪酸等抗菌活性物質有關。 根據產品的型別，可以通過兩種方式新增後生元：混合和噴灑，測試表明這兩種方法都能有效抑制病原菌。 也有研究發現，後生元可以緩解食物過敏症狀。 後生元還可用作包裝紙的原料，浸漬細菌奈米纖維素製備新型抗菌奈米包裝紙，並用作生物膜控制的抗菌膜劑。 雖然後生元比抗生素和化學防腐劑有一定的優勢，但存在抗菌譜窄、生產成本高等問題，成為其應用中不可忽視的因素。
後生元的製備及鑑定方法
2.1 一種後生元的製備方法
後生元的製備遵循滅活細菌和保持有益特性的原理。 其製備方法包括高溫、高壓、酶處理、超聲波、伽馬輻射、溶劑萃取、超臨界流體技術、噴霧乾燥和冷凍乾燥。 高溫是後生元製備的常用方法，工業生產中一般採用高溫滅活法，選取的優質菌株經特殊培養和熱封技術處理，得到後生元製劑。 當使用高溫滅活細菌時，時間和溫度取決於細菌本身的耐熱性和測試所需的益生元的特性。 細菌的高溫滅活操作簡單，但對有益物質的活性有一定的影響，因此研究人員開發了不進行熱處理的方法。 Li等人將植物乳桿菌C88與溶菌酶在37孵育30 min，然後進行超聲裂解，然後離心除去細胞碎片，得到上清液作為植物乳桿菌的後生元製劑。 活性物質的提取可以根據其性質進行，如有機溶劑提取多醣或大分子蛋白質，超臨界流體技術提取醣脂等。 益生菌發酵液經滅菌處理，再經噴霧乾燥或冷凍乾燥製成乾粉，可提高產品的迴圈和便利性。 針對製備方法的多樣性，根據菌株特點和後生元的健康使用，選擇了一種快速、可控、經濟的製備方法。
2.2 後生元成分的分析鑑定方法
後生元不是一種單一的化合物，而是多種成分的混合物。 雖然後生元已被證明具有多種作用，但對發揮特定作用的活性成分的分析和作用機制是後生元研發中需要解決的問題。 後生元成分的鑑定方法複雜多樣，常用的鑑別方法有氣相色譜、液相色譜、氣相色譜-三重四極杆串聯質譜、液相色譜-三重四極杆串聯質譜、薄層色譜、核磁共振波譜、傅利葉變換紅外光譜、分光光度法、掃瞄電子顯微鏡和原子力顯微鏡、拉曼光譜光譜學、基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜等鑑定方法的選擇取決於後生元的研究目標和所追求的表徵型別（定性或定量）。 GC和GC-MS是用於短鏈脂肪酸、揮發性化合物（如二乙醯基、丙酮和二甲基碸、2-丁酮）和有機化合物的定量和定性分析最常用的分析工具。 LC和LC-MS也是鑑定後生元化學成分的常用方法，可以準確、系統、快速地鑑定。 Gao等人通過LC MS-MS分析從鼠李糖乳桿菌的GG發酵上清液中鑑定出一種新的分泌蛋白（HM0539）。 研究人員還通過超高效液相色譜-高分辨質譜法鑑定了嗜酸乳桿菌和加氏乳桿菌發酵上清液中的97種代謝物和71種脂質。 此外，Fuochi 等人使用 NMR 波譜來檢測和定量不同乳酸菌株產生的無細胞上清液中的代謝物（例如氨基酸、有機酸、單醣、酮和醇）。 MALDI-TOF是一種用於鑑定後生元製劑中蛋白質成分的新工具。 TLC、FTIR和分光光度法都是快速定性檢測方法。 拉曼光譜可以檢測細菌成分的生物活性。 掃瞄電子顯微鏡和原子力顯微鏡主要用於表徵大分子物質的理化性質。 由於後生元成分的複雜性，鑑定方法通常是多種技術的組合。
後生元的工業應用
ISAPP關於後生元的官方宣告指出，後生元的上市產品必須滿足以下條件：1）細胞微生物的分子表徵（如完整的基因組序列），以準確識別和篩選潛在的安全隱患基因;2）詳細描述滅活步驟和程式;3）確認已發生滅活;4）成分的詳細說明;5）進行高質量的試驗，並有真實世界的證據證明對宿主的健康益處;6）評估其製劑在目標宿主中的預期用途及其安全性。在充分的科學研究和臨床試驗的支援下，後生元產品的商業化路徑發展迅速[8]。 羅伊氏乳桿菌 DSM 1768 的滅活對幽門螺桿菌 H 有效幽門螺桿菌），其作用原理是滅活幽門螺桿菌中宿主胃的細菌幽門螺桿菌特異性結合，掩蓋 H幽門螺桿菌表面結構與H形成滅活細菌幽門螺桿菌，可防止其粘附在胃粘膜上並排出體外。 多項研究證明，熱滅活植物乳桿菌L-137，包括滅活細菌和代謝產物，具有調節免疫系統、維持腸道菌群平衡和改善乾燥度的功能，產品已廣泛應用於飲料、麵包、糖果、拉麵等食品中。 目前後生元的工業應用見表2。
表2後生元的工業應用
table 2 industrial appication of postbiotics
展望
2020年8月20日，中國食品科技學會發布“益生菌科學研究十大熱點”，《益生菌與後生元》位列其中，並首次入選後生元，說明科研界對後生元寄予厚望。
作為乙個新事物，後生元在其研究和應用領域仍有許多問題需要解決。 例如，對後生元中發揮特定作用的效應分子進行分析鑑定，並闡明其作用機制。 後生元的療效評價和安全性仍需通過大量臨床試驗進行驗證。 法律法規和標準的滯後以及消費者的認知在一定程度上限制了後生元的商業化發展。 儘管如此，後生元的“多功能性”和安全性、穩定性的優勢使其在食品、保健品、醫療、化妝品、飼料等多個領域具有巨大的市場潛力。 未來，“後生元產品”和“後生元**”可能會成為大眾的“首選”。
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