基於mRNA的藥物和疫苗的快速發展及其廣泛應用標誌著生物技術領域的重大變革。 儘管mRNA已顯示出巨大的潛力，但其安全性和潛在毒性問題不容忽視。近日，《自然》雜誌的子期刊《自然評論藥物發現》發表了一篇評論文章本文深入分析了與mRNA**相關的毒性問題，重點分析了脂質奈米顆粒（LNPs）的結構和製造工藝、給藥方式以及目前用於消除mRNA製劑潛在風險的方法和新興策略。 今天，藥明康德內容團隊將為您解讀本綜述的精彩片段。 
與傳統**方法相比，mRNA技術顯示出獨特的優勢，例如其快速生產能力和應用於各種疾病的潛力。 然而隨著該技術在臨床上的日益普及，它安全性問題逐漸成為研究和應用的重點，特別是在潛在毒性風險的管理和解決策略方面。隨著mRNA技術臨床應用的不斷拓展，迫切需要解決這些安全性挑戰，以保證mRNA技術的長期可持續發展。 影響mRNA臨床轉化的關鍵因素
mRNA 的關鍵步驟之一是通過體外轉錄 （IVT） 合成 mRNA 序列。 該過程通常涉及使用噬菌體 RNA 聚合酶催化線性化質粒 DNA 與核醣核苷酸結合，從而產生 RNA 轉錄本。 然而，該方法產生的未修飾的 mRNA 分子（即 IVT mRNA）受到高免疫原性和低細胞內遞送效率的挑戰。 mRNA臨床應用的成功歸功於兩個重要進展：一是利用化學修飾等策略降低IVT mRNA的免疫原性; 二是開發LNP等高效遞送系統，確保mRNA能夠高效遞送至細胞中。這兩項進展共同推動了mRNA的發展，使其成為一種有前途的策略。 
1.消除 IVT mRNA 的免疫原性IVT mRNA 能夠結合並調節 Toll 樣受體 3 （TLR3） 的表達，從而啟用 NF-B 並引起下游炎症因子的轉錄上調。 沒有特異性化學修飾的 IVT mRNA 也可以啟用 TLR7 或 TLR8，觸發促炎細胞因子的產生，並在 CD4+ 和 CD8+ T 細胞中誘導初級免疫反應。 除上述途徑外，這些未修飾的IVT mRNA還可能通過非TLR模式識別受體觸發免疫反應。 為了使IVT mRNA在臨床應用中具有更好的安全性和有效性，消除其潛在的異常免疫原性是關鍵一步。 研究表明，通過引入核苷甲基化和假尿苷等化學修飾，可以顯著降低體外轉錄單鏈RNA（IVT ssRNA）的免疫原性。這些化學修飾能夠減少樹突狀細胞中炎性細胞因子的分泌，避免啟用相關的炎症通路，從而減少未修飾的ssRNA分子可能引發的免疫反應。 另外這些化學修飾也有助於提高性mRNA的功效。 除上述技術手段外，在mRNA純化過程中去除雙鏈RNA（dsRNA）雜質也是提高mRNA穩定性和免疫原性的關鍵步驟。使用特定的核苷酸修飾技術，如新增poly（a）尾和2-O-甲基化核醣修飾，也可以進一步增強mRNA分子的穩定性，並有效降低其免疫原性。 此外，為了解決細胞中線性mRNA半衰期短的問題，研究人員還提出了包括環狀mRNA在內的新型體外RNA工程技術。 這些技術不僅延長了mRNA的細胞內存活時間，而且通過降低免疫原性、提高蛋白表達效率，為mRNA的應用提供了更堅實的基礎。 
2.mRNA的細胞遞送然而，細胞遞送是實現高效 mRNA** 的關鍵長 mRNA 分子由於其大尺寸和負電荷而難以快速穿透磷脂雙層。 另外mRNA很容易被核糖核酸酶在細胞內和血液中降解。為了克服這些挑戰，研究人員採用LNP作為載體來保護mRNA，以提高其穩定性、細胞攝取和蛋白質翻譯效率。 典型的 LNP 製劑包括可電離脂質、聚乙二醇化脂質、膽固醇和輔助脂質，它們共同影響 LNP 的活性和穩定性。 此外，由於LNP自組裝是由靜電相互作用和脂質兩親性驅動的由此產生的LNP特性（例如，大小、表面電荷和組成）取決於脂質比和脂質分子的性質。隨著研究人員對RNA生物學和LNP工程的理解不斷加深，mRNA藥物的藥代動力學和藥效學都有了顯著的提高。 mRNA的當前遞送方法**和潛在的安全風險
mRNA藥物的給藥途徑與其預期用途和相關疾病的病理生理特徵密切相關。 為了適應不同的給藥途徑，必須調整製劑的引數（例如，粒徑和脂質組成）以優化其生物製藥特性，特別是對於特定的器官親和力。 目前，用於mRNA藥物的主要遞送方式包括：1.肌內和瘤內給藥肌內和瘤內給藥方式在臨床試驗中佔主導地位，它們也是癌症免疫的首選給藥途徑**。 研究表明，肌肉注射的 mRNA 疫苗能夠引發關鍵的免疫反應。 注射 LNP-mRNA 複合物後，樹突狀細胞、單核細胞和中性粒細胞在注射部位積聚，導致短暫的區域性炎症反應，與皮下給藥相比，這種反應通常是輕微的。 
123RF 此外，值得注意的是，LNP-mRNA疫苗中的可電離脂質是佐劑，在動物模型研究中被發現可促進IL-6的產生、特異性CD4+ TFH細胞和生髮中心B細胞分化。 這表明可電離脂質本身，而不是mRNA，可能通過刺激先天免疫系統來充當佐劑。然而還有研究表明，mRNA 有效載荷本質上是佐劑，能夠在動物模型中誘導強大的 CD8+ T 細胞反應。 這些發現表明：LNP-mRNA疫苗的佐劑和免疫原性可能取決於脂質和核酸成分，其潛在的免疫刺激協同作用有待進一步開發**。 2.皮內和皮下給藥皮內給藥可有效啟用朗格漢斯細胞和樹突狀細胞，增強免疫反應。研究表明，與電穿孔技術相比，皮內給藥 mRNA 具有更高的轉染效率，並且可以促進淋巴生長，從而導致淋巴水腫。 另外皮下給藥還能夠誘導強大的細胞毒性 T 細胞免疫反應，在黑色素瘤模型的小鼠中顯示出療效
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3.靜脈給藥mRNA藥物靜脈給藥後，主要分布於脾臟和肝臟。 肝臟獨特的生理特性，如高血流量和小體積的竇狀血管，促進了肝細胞和非實質細胞對LNP-mRNA顆粒的吸收這使得肝臟成為主要的被動靶點。 然而，這也限制了LNP-mRNA顆粒在肝臟外的生物分布。鑑於 mRNA 的半衰期較短，可能需要定期重構以維持其**效果。LNP-mRNA製劑可能會引起免疫原性反應，在抗炎藥無法避免或抑制的情況下，管理這些免疫反應以避免重複給藥引起的慢性炎症至關重要。 基於聚乙二醇（PEG）的奈米藥物製劑反覆給藥面臨的乙個問題是加速血液清除（ABC）現象，這會削弱藥物的藥代動力學特性。 ABC現象的機制涉及在首次給藥後產生針對PEG成分的IgM抗體，這些IgM抗體介導的補體啟用增強了顆粒的吞噬作用，特別是在肝臟中，這可能導致LNP-mRNA製劑在肝臟中的半衰期縮短和生物分布增加。因此，在設計LNP-mRNA製劑時，需要考慮PEG組分與預期用途和給藥方案的相容性，以規避這些潛在問題，並確保製劑的長期安全性和有效性。 
***123rf4.口服
儘管口服給藥因其高患者依從性而受到青睞，但在 LNP-mRNA** 領域仍未得到充分利用。 口服給藥的乙個重要挑戰是胃液的酸性環境，這可能導致可電離脂質的質子化，導致胃腸道中 mRNA 負荷過早釋放，以便被核酸酶降解。此外，即使是LNP-mRNA顆粒也能夠在胃的酸性環境中或通過胃腸道中脂肪酶和酯酶的作用來保持其結構完整性它在體內的可用性仍然受到腸上皮細胞表面粘液醣蛋白層的限制。 避免 LNP-mRNA 安全風險的可用策略
幾項臨床前研究探索了使用微針技術進行皮內給藥的策略，以保護 mRNA 免受 RNA 酶的破壞，同時減少不良反應的發生。 實驗結果表明：負載mRNA的可溶性聚合物微針和中空微針在增強疫苗免疫原性方面表現出優異的效能。 聚肌氨酸作為PEG的替代品，可有效降低對聚乙二醇化脂質的不良免疫反應，並能與RNA形成電荷性質可調的奈米顆粒。 此外，由多肌氨酸-脂質與 mRNA 偶聯形成的複合物能夠達到與聚乙二醇化 LNP-mRNA 製劑相似的蛋白表達水平，同時提供更好的安全性，包括更低的炎症和肝毒性。 為了規避LNP-mRNA藥物的潛在安全風險，目前可用的策略包括系統地合成和篩選可電離脂質、實施組合**、最大限度地減少脫靶效應以及開發環狀mRNA。總之，這些策略為mRNA**的安全性和有效性奠定了堅實的基礎。 
***123rf1.可電離脂質的合成和篩選可電離脂質在 LNP-mRNA 製劑中起著關鍵作用，頭部基團通常具有較低的解離常數，有助於促進內體中 LNP-mRNA 結構的解聚，而烴尾部則促進 mRNA 釋放到細胞質中。 組合化學策略允許快速合成和篩選新脂質，以優化轉染效率並降低毒性。 2.投資組合策略研究發現通過與其他藥物或佐劑聯合使用，可以提高mRNA藥物和疫苗的有效性並降低風險。例如，在一項臨床前研究中，編碼 IL-12、IL-27 和 GM-CSF 的 LNP mRNA 與暴露的 IL27 mRNA 的組合顯著抑制了小鼠黑色素瘤模型中的腫瘤生長，其效果是單獨使用 LNP mRNA 的十倍。 在另一項研究中，編碼粘蛋白 1 （MUCIN-1） 的 LNP mRNA 與 CTLA-4 單轉殖抗體聯合給藥可啟用小鼠模型中的腫瘤特異性 T 細胞，並且與單獨使用 LNP mRNA 相比顯著抑制腫瘤生長**。 使用免疫抑制劑是化療期間的標準做法，該策略也適用於基於核酸的產品。 例如，將地塞公尺松整合到裝載有螢光素酶mRNA的LNP中可以減少小鼠細胞因子的產生，而不會引發急性體外細胞毒性。 在另一項研究中，糖皮質激素和抗組胺藥在給予基於 LNP 的 CRISPR-Cas9 基因編輯**之前給藥，以減輕轉甲狀腺素蛋白澱粉樣變性患者可能發生的全身先天免疫反應。 此外，其他小分子藥物，如JAK抑制劑和依達拉奉，也被發現可有效減弱與脂質相關的不良免疫原性。 這些發現凸顯了聯合**策略在增強mRNA藥物和疫苗功效方面的潛力。 
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3.將脫靶效應降至最低研究表明：LNP包膜的siRNAs在肝細胞中的趨性可以通過化學工程來調節脂質的PKA值。為了減少mRNA**發育中的脫靶效應，研究人員採用了兩種策略：第一種是借助內源性microRNA（MIR）特異性抑制mRNA翻譯，其次是通過優化LNP-mRNA複合物的器官特異性攝取來提高靶器官中LNP-mRNA複合物的利用效率。 特別是，LNP-mRNA技術的最新進展使得靶向非肝臟器官成為可能，同時還改善了肝內細胞的嗜性，從而進一步減少了潛在的脫靶效應。 具體說來通過引入永久電荷脂質來調節LNP的生物分布，可以實現對特定器官（如肺、脾臟或肝臟）的優先靶向。其他研究已經探索鞘磷脂採用調節LNP-mRNA生物分布的策略，通過延長奈米顆粒在小鼠體內的迴圈時間，改善LNP-mRNA的肝外分布。 進一步的研究還表明，通過化學工程技術調節脂質的PKA值可以精細控制LNP封裝的siRNA在肝臟中不同細胞型別的分布，為提高**的靶向性和減少脫靶效應提供了有效的方法。 這些策略的全面應用不僅有望提高mRNA**的準確性，而且為減少潛在的脫靶效應提供了重要的科學依據。 
***123rf結論
mRNA疫苗的成功標誌著生物**領域的乙個重大轉折點，製藥行業越來越多地使用mRNA技術來開發罕見病、癌症和傳染病的創新藥物。 藥物開發的成功很大程度上取決於其安全性，然而，mRNA**安全風險並非易事。 作為乙個多組分實體，LNP封裝的IVT mRNA的整體生物活性可能不僅僅是其單個組分的新增。 LNP-mRNA製劑的藥理作用和潛在毒性不僅與其顆粒性質有關，還與脂質化學和mRNA翻譯產物有關。 鑑於LNP-mRNA製劑的複雜性，其臨床前開發需要一種跨學科的方法，整合奈米技術、生物化學、藥理學和組織工程領域的技術。 具有複雜成分的mRNA的開發需要超越傳統小分子藥物開發的先進技術這包括開發更準確地反映人體生理和病理狀態的研究模型，以及應用人工智慧引導的藥效學模型和毒性基因組網路來提高資料解釋的質量。 此外，單細胞技術的應用極大地豐富了對體外和離體單細胞藥物反應異質性的認識。具體來說，通過結合下一代測序、DNA條形碼和單細胞RNA測序等技術，研究人員能夠準確識別優先靶向體內特定細胞亞型的LNP-mRNA組合。 此外，單細胞技術可以幫助優化LNP-mRNA製劑，以確保藥效學特徵符合預期，並確定不良反應是否具有組織特異性，從而允許早期干預。 綜上所述，基於mRNA的技術發展需要綜合的多學科方法，包括利用體外毒性篩選、組學資料分析、實時跟蹤LNP和mRNA技術進展，這對降低mRNA研發風險、降低專案淘汰率具有重要意義。