拉曼訊號分析技術支援“無標記”引領生化檢測新正規化

Mondo 科技 更新 2024-02-24

“我堅信,markless將被主流所接受,甚至在許多方面超越傳統的測試方法。 ”——中國科學技術大學褚凱勤教授在談到生化顆粒檢測技術的未來方向時自信地說。

那麼究竟什麼是“無標記”呢?

“無標記”是指在不進行螢光染色的情況下對化學樣品的物理和化學性質進行監測、引數表徵和相關分析。 具有無光漂移或光毒性,對樣品製備要求低,及時全景觀察等優點。

相較於對細胞樣品具有嚴重破壞性或光毒性的“免疫沉澱”和“螢光染色”,“無標記”可以在不破壞樣品原始狀態的情況下,長時間最大化觀察結果,並且以這種方式獲得的結果最接近樣品在自身環境中的效能。 無論是對生物樣品活性的觀察,還是對藥物作用機制的研究,“無標記”可能是未來最科學、最有價值的參考方式。

然而,如果不對樣品進行標記,樣品中那些小而微弱的顆粒是很難觀察到的,特別是在快速活動或結塊的狀態下。 這些問題可能會阻礙“無標記”生化檢測技術的應用。

楚凱勤教授團隊多年致力於拉曼訊號分析技術、影象演算法等領域的研究,並成功打破了行業內的這一技術壁壘,讓“無標記”服務於生化檢測領域,並取得了一系列優秀的研究成果。

在這裡,我們必須清楚“拉曼”的概念。

拉曼訊號是一種非常微弱的非彈性散射訊號(只有散射光的1 10 9左右),與瑞利散射(散射光與入射光的波長相同)相比,拉曼訊號的波長會隨著被測樣品化學結構的不同而變化,具有很大的應用價值。 然而,由於訊號較弱,在實際應用中面臨多重技術障礙。 褚凱勤教授及其團隊致力於拉曼訊號分析技術的應用和研究,通過對單粒子光鑷自動捕獲和釋放技術、相位引導拉曼分析、拉曼訊號演算法分析等方面的研究,拉曼訊號分析技術在具體的研究專案中得到應用,“無標記”生化檢測技術在多個方面取得了突破。
接下來,就為大家介紹一下楚凱勤教授團隊研發的“踢館”傳統檢驗檢測方法的一系列成果。 內容較長且可選**,專業人士可以在每個系統章節的末尾找到**位址**。 奈米顆粒多引數表徵分析系統

這是乙個由多模態光鑷系統+綜合控制系統+多模態資料分析系統組成的平台,可以利用拉曼訊號分析技術,對粒徑在100nm-500nm範圍內的顆粒進行“單顆粒”水平上快速表徵功能化奈米顆粒和病毒、細菌、外泌體、亞細胞器等天然生物奈米顆粒的理化生化性質。

該系統的三大特點:

“單顆粒”表徵技術實現了單個顆粒的多個引數同時表徵,如尺寸、折射率、組分的絕對分布等資訊。 特別適用於單顆粒異質性高的樣品分析。

支援自動捕獲和釋放樣品溶液中的單個顆粒。

在深度學習演算法的支援下,在完整和欠定化學模型的光譜分析中,自動去除背景,實現高速計算。

系統引數:

適用尺寸範圍:100nm-500nm;

表徵20-100小時的通量;

拉曼光譜訊號採集時間最快<10s;

尺寸、折射率和化學成分的表徵精度誤差分別不高於%和5%。

應用:

物理、製藥、能源材料、環境、功能產品等領域。

如:外泌體大小及化學成分分析;

脂質體封裝技術的藥代動力學研究;

藥物包封率的檢測與分析;

表徵和分析其他異質性的單個顆粒引數。

實驗案例展示:

圖1 系統測試結果

我們使用不同尺寸和材料的標準奈米球進行驗證,臨床血漿的載藥脂質體和外泌體**。 (上圖)標準顆粒上校準系統的粒徑、折射率和化學成分的表徵誤差。 (中)可以進一步驗證奈米脂質體上的系統表徵(下圖) 通過多模態資料可以進行奈米顆粒的定量成分分析和分層分析。 最終校準得到的化學成分粒徑、折射率和定量表徵精度的誤差率分別為3-5%和1%5% 和 48%。

圖1(上)和(中)也顯示,粒度測試結果與商業儀器的結果吻合良好。 如圖1(下圖)所示,通過多模態資料的正交資訊融合,系統可以進一步提取獨特的形態資訊,如層狀度(即脂質體中磷脂雙層的數量),其分析結果往往與“標準”冷凍電鏡成像的分層統計相似。

圖2:血漿外泌體的臨床特徵。

a) 表徵血漿外泌體的粒徑、折射率和化學成分。(b)基於PCA+HCA的外泌體簇分析。 (c)不同同種型外泌體的成分差異。 (d) 訓練和驗證集中不同同種型的外泌體的平均光譜。

這些數字和資料均來自我們專案組的實驗,並在Analytical Chemistry、The Analyst、BioMed Opt Express等期刊上發表論文4篇。

引文**:1. combined morpho-chemical profiling of individual extracellular vesicles and functional nanoparticles without labels,yichuan dai, suwen bai, chuanzhen hu, kaiqin chu, bing shen*, and zachary j. smith*

anal. chem. 2020, 92, 7, 5585–5594

2. hybrid principal component analysis denoising enables rapid, label-free morpho-chemical quantification of individual nanoliposomes,yichuan dai*, yajun yu, xianli wang, ziling jiang, yulan chen, kaiqin chu, and zachary j. smith*

anal. chem. 2022, 94, 41, 14232–14241

3. multicomponent raman spectral regression using complete and incomplete models and convolutional neural networks†,derrick boateng, chuanzhen hu, yichuan dai, kaiqin chu, jun du* and zachary j. smith *

the analyst. 2022, 147(20)

4. deep learning-based size prediction for optical trapped nanoparticles and extracellular vesicles from limited bandwidth camera detection,derrick boateng, kaiqin chu, zachary j. smith, jun du,and yichuan dai

biomed opt express. 2024 jan 1; 15(1): 1–13.

相位引導拉曼取樣分析系統

這是一種由無標記相位顯微鏡+深度學習+拉曼光譜組成的新型觀察方案,可實現細胞器的長期、無標記、快速的“形態化學”多模態觀察。 該系統可用於通過影象採集和分析來表徵細胞器的形態資訊(大小和位置)和上下文資訊(與其他細胞器的關係,如脂滴到線粒體、脂滴和細胞核),可用於相關性分析。

該系統的四大特點:

檢測速度很快,在傳統的拉曼顯微鏡掃瞄過程中,甚至可能需要一天時間才能獲得單個細胞內的訊雜比(SNR)細胞器群譜。 我們能夠在受控的測量時間內(每個細胞大約10分鐘)輕鬆獲得SNR,並且每個光譜都有乙個SNR。 動態跟蹤亞微觀細胞器(例如脂滴)和生化引數的體內表徵。 過耦合高解像度相位成像和拉曼光譜能夠準確收集細胞器簇內單個細胞器的光譜。 對於具有非空間均勻性的細胞器(例如,相分離的巨型單層囊泡),可以使用混合取樣方法,其中粒子(在激發點)在單個點上取樣,並在其空間範圍內以光柵形式掃瞄粒子。 然而,系統的相通道引導用於“跳過”細胞樣品的無害區域,以便快速檢測。

圖 3:系統相位影象和拉曼光譜分析

圖4:系統分析功能。

應用:

它可以表徵和分析脂滴、線粒體和溶酶體等細胞器的位置、數量、環境和化學組成。

脂滴和線粒體的光譜變化可用於研究各種細胞器之間物質交換的機制。

可研究藥物治療下細胞中脂滴的形態和組成變化,為相關藥物檢測提供多模態資訊和定量分析。

藥物研究、脂質代謝研究等。

實驗案例展示:

圖5:脂滴的形態學和組成分析。

通過結合相位顯微鏡和拉曼光譜,我們能夠以比傳統點掃瞄拉曼顯微鏡快約600倍的速度快速量化固定細胞內脂滴的形態和組成。

圖6:脂滴形態和化學成分的精確定量。

圖7 脂滴的連續觀察與分析3.

這些數字和資料均來自我們專案組的實驗,並在分析化學上發表了1篇論文。

引文**:

1.rapidintracellulardetectionandanalysisof lipiddroplets'morpho-chemical compositionby phase-guided ramansampling

haozhang,jingdefang,yichuandai,yangpan,kaiqinchu,*andzacharyj.smith*,citethis:anal.chem.2023,95,13555−13565

細胞器特異性相差顯微鏡

該系統的功能是自動分析未標記細胞中多個細胞器的動力學引數和相互作用,實現整個細胞器動力學和相互作用的無標記視覺化和分析。

該系統的四大特點:

線粒體和溶酶體可以通過單個2D強度影象進行識別和跟蹤,影象採集由顯微鏡完成,動態識別全部由演算法完成,具有高度的智慧型性。

使用低光子通量(比雷射激發螢光照射的通量低約 40 倍)成像以及以最小干擾觀察和自動分析線粒體裂變和融合速率可產生更接近理論上未觀察到的狀態的結果。

為了對結果進行定量分析,我們計算了幾個指標,如結構相似性指數(SSIM)、多尺度SSIM(MS-SSIM)和皮爾遜相關係數。 通過對上述三個指標的定量分析,我們可以系統地評估所提出的演算法或模型在細胞內溶酶體和線粒體位置和形態方面的準確性和可靠性。

我們還可以新增乙個螢光通道,用單個標記(不需要多個螢光通道和多個染色)來分析細胞膜、細胞核、線粒體和蛋白質四種結構之間的相互關係。

應用:觀察各種細胞器(包括線粒體、溶酶體、內質、脂滴等)之間的相互作用。

物理刺激(如低溫、pH、飢餓等)和藥物刺激(如FCCP、Erestin等)下線粒體、溶酶體和其他細胞器的應激狀態和定量統計分析。 線粒體融合和融合、溶酶體運動和線粒體-溶酶體接觸位點 (MLC) 的檢測。 可觀察物件:線粒體、溶酶體、內質、脂滴、囊泡、染色體、細胞核、細胞膜等。

實驗案例展示:

圖8 線粒體與DRP1的相互作用

我們的系統可以看到線粒體、DRP1 和內質動力學,類似於傳統螢光成像中的動態。 (a) DRP1參與線粒體裂變; (b) DRP1引起線粒體收縮而不發生裂變; (c) DRP1向線粒體的定向遷移; (D) DRP1 遵循線粒體運動。

圖 9:線粒體和 DRP1 卵子分布的細胞平面分析。

a) 細胞膜、細胞核和線粒體的鑑定;(b) 線粒體到細胞核的距離:線粒體到細胞核的相對距離; (c)線粒體向細胞核和細胞膜的分布具有一致的趨勢; (d) 滾球法和閾值處理提取DRP1聚集體; (e) DRP1分布**軟骨周,30%的DRP1與線粒體共定位; (e) 與 DRP1 的線粒體距離。

圖10:線粒體動力學分析。

在圖 A 的頂部,線粒體是 73 秒處的兩個線粒體。 在底部,兩個線粒體在 225 秒時融合成線粒體。 呈現了 10 分鐘內的初始線粒體影象和運動。 d f 顯示釋放部分。 不僅可以看到起始位置(深藍色圓點表)和結束位置(紅點表),還可以看到這個時間段的運動軌跡e和f,裂變和融合過程在三幀中展開,裂變前後的兩條線粒體線連線起來。

圖11:溶酶體動力學分析。

A 和 B 是正常培養和飢餓細胞的影象。 可以觀察到,在飢餓的細胞中,細胞器往往比正常細胞更多地聚集在細胞核周圍。 可以跟蹤每個溶酶體的運動軌跡,圖11c中顯示了正常細胞的單個示例。 然後,我們計算了每個溶酶體的平均置換(MSD)。 通過將MSD與異常擴散模型擬合,我們得到了異常擴散因子(在5秒內對10個隨機選擇的軌跡的分析結果如圖11d和e所示)。 圖 11f 顯示了所有溶酶體軌跡的分布(每組 10 個細胞)。 與正常細胞相比,飢餓細胞中溶酶體的運動範圍更有限 (1)。 鑑於溶酶體傾向於在飢餓細胞的細胞核周圍聚集(圖11B),預計它們的運動範圍將更加有限。 此外,我們還可以通過單元級值(即單個單元內所有軌跡的平均值)來反映整個單元的狀態。 結果如圖11g所示。 可以看出,將飢餓細胞的值與正常細胞的值進行比較,這進一步證實了圖11f中的結論。

這些數字和資料均來自我們專案團隊的實驗,其中1篇論文發表在ACS Photonics上。

引文**:

1.label-free analysis of organelle interactions using organellespecific phase contrast microscopy (os-pcm)jingde fang, hao zhang, yang pan, zachary j.smith,* 和 Kaiqin Chu*引用此內容:ACS Photonics 2023, 10, 1093 1103 如何防止學術欺詐私信我們的團隊以了解更多資訊

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