從歷史上看，用於識別神經啟用的最廣泛使用的分子標記是即刻早期基因 （IEG），例如 FOS。 然而，沒有可比的分子標誌物可用於識別神經活動減少。 蛋白質翻譯後修飾 （PTM），例如磷酸化，受細胞活性的快速和雙向調節，並具有作為細胞活性“開關”標誌物的分子基礎。
2024年1月17日，美國斯克里普斯研究所的研究人員發表了神經科學領域的頂級期刊neuron(if:16.2）發表了題為“Phosphorylation of pyruvate dehydrogenase inversely-associates with neuronal activity”的論文。在這項研究中，使用光遺傳學技術+磷酸化蛋白質組學來發現一種不同的標誌物，可以靈敏地標記神經活動的下降 - PPDH（磷酸化丙酮酸脫氫酶），它與先前指示神經活動增加的標誌物不同。 這種逆向活動標記 （IAM） 可以與 IEG 或其他標記結合使用，以描述和識別由經驗或行為引起的雙向神經動力學。
研究材料
光遺傳學技術誘導的低活性和高活性的初級皮層神經元;
小鼠模型（麻醉、化學遺傳學、視覺刺激、缺水-飲用、禁食-再餵養）。
技術路線
第一步：建立基於光遺傳學技術的神經元啟用平台;
步驟2：磷酸化蛋白質組結果顯示，磷酸化PDH（PPDH）與神經活動呈負相關。
第 3 步：在原代細胞中，PPDH 與神經活動動態相關;
第 4 步：在體內，PPDH 與實驗誘導的神經活動抑制相關;
第 5 步：PPDH 與感官體驗誘導的神經活動呈負相關;
第 6 步：PPDH 和即刻早期基因 （IEG） 聯合指示內在狀態誘導的神經啟用和抑制;
第 7 步：PPDH 揭示了與下丘腦外側攝食行為相關的細胞型神經動力學。
發現：
1.建立基於光遺傳學技術的神經元啟用平台
研究人員在原代皮層神經元上表達光敏通道蛋白（ChannelRhodopsin-2（CHR2），以建立基於光遺傳學技術的神經元啟用平台。 光刺激產生大量具有同步、精確放電模式的神經元。 在 10 cm2 區域，10 ms、5 mW mm2 470 nm 光刺激足以激發高達 10 Hz 的動作電位，同時獲得超過 106 個具有同步動作電位的神經元。 這些啟用的神經元具有直接早期基因 （IEG） 的 mRNA 表達顯著公升高，例如 FOS、ARC 和 NPAs4。
圖1 光遺傳學技術獲得具有同步和精確放電模式的神經元。
2.磷酸化蛋白質組學檢測顯示，磷酸化PDH（PPDH）與神經活動呈負相關
研究者向動作電位發射 0對 5 Hz（慢速、低活性）和 10 Hz（快速、高活性）神經元進行磷酸化蛋白質組檢測，共檢測到 7543 個磷酸化肽和約 50 個顯著差異化的磷酸化肽。 選擇兩個下調磷酸化位點PDH E1亞基1A、Ser293和Ser300（PDH1A，簡稱PPDH）作為後續研究的靶點。
PDHA1A 是丙酮酸脫氫酶複合物 （PDC） 中的一種限速酶，可控制丙酮酸進入三羧酸氧化物迴圈 （TCA）。 TCA的啟用已被證明是神經元放電所必需的。 PDH的磷酸化抑制酶活性，而其去磷酸化啟用PDH，進而產生更多的ATP。 這一結論與研究人員的發現一致，即當神經元高速放電（高活性）時，PPDH顯著下調。 研究人員認為，當神經元高度活躍時，PDH被去磷酸化，增加ATP的產生，以滿足神經元的高能量需求。 基於這種功能相關性和商業單轉殖抗體的易得性，研究人員決定測試 PPDH 是否可以用作反向活性標誌物 （IAM）。
圖2 磷酸化蛋白質組學分析顯示PPDH與神經活性呈負相關。
3.在原代細胞中，PPDH與神經活動動態相關
在原代神經元中同時檢測到 PDH Ser293 和 Ser300 的磷酸化。 研究人員繼續檢查這兩個位點在小鼠不同大腦區域的磷酸化，發現PSE293 PDH是體內的主要形式。 因此，研究人員將重點放在PSER293 PDH。
在5 Hz連續光遺傳學刺激的條件下，研究人員檢測到PPDH低於10 Hz。 停用 50 分鐘後，PPDH 恢復到與基線相當的水平。 藥理抑制後，PPDH公升高，加入KCL後逆轉。 以上結果顯示：PPDH可以是雙向的，並受神經元活動的反向調節。
圖3 體外PPDH與神經元活性呈負相關。
4.在體內，PPDH與實驗誘導的神經活性抑制有關
然後，研究人員測試了PPDH是否可以用作體內神經活動的組織學標誌物。 研究人員首先測量了異氟烷麻醉引起的神經活性抑制後的 PPDH 水平。 結果顯示，2小時的麻醉導致大腦區域廣泛的FOS免疫螢光訊號丟失，而研究人員檢測到多個大腦區域的PPDH顯著上調。 與早先的報道一致，研究人員還發現，麻醉導致視上核中的FOS顯著公升高，而在該區域的一組離散神經元中檢測到高PPDH。 此外，並非所有區域都存在高 PPDH，例如海馬體的 CA3 區域、外血腦屏障 （BBB），並且 PPDH 對異氟烷麻醉無反應。 因此，與即刻早期基因 （IEG） 一樣，PPDH 標記具有區域偏好、偏倚和差異。 有趣的是，在很早的時候（麻醉後1小時），可以在大腦區域檢測到強烈的PPDH，而FOS的缺失並不明顯這反映了這樣乙個事實，即與直接早期基因 （IEG） 的表達相比，PPDH 具有更快的動態特性。
圖 4-1 PPDH 與麻醉中的神經活動呈負相關。
此外，研究人員還發現，PPDH可以標記被化學遺傳學等常見電路操作技術沉默的神經元。
圖 4-2 PPDH 與化學遺傳學誘導的神經活動呈負相關。
5.PPDH與感覺體驗誘導的神經活動呈負相關
研究人員繼續採用小鼠視覺刺激方案來檢測視覺通路中 PPDH 的動態變化。 首先將小鼠保持在黑暗中48小時（視覺剝奪），然後暴露於明亮的視覺刺激4小時以誘導神經元活動，然後再次回到黑暗中2小時和12小時（此時視覺刺激誘導的活動有望消退）。 與文獻報道一致，初級視覺皮層（V1）、膝狀外側核（LGN）和邊緣內嗅皮層（LENT）中的FOS訊號在4 h時被視覺刺激強烈誘導，並在2 h後緩慢恢復到基線水平。 相反，在小鼠重新進入黑暗環境2小時後，所有三個區域的PPDH訊號都顯示出急劇增加，表明：視覺刺激的停止（從而減少視覺通路的啟用）可以被PPDH迅速捕獲。 基於細胞標記物染色，發現大多數PPDH標記的細胞是neun+神經元。
圖5 PPDH與視覺刺激中的神經活動呈負相關。
6.PPDH 和即刻早期基因 （IEG） 的組合表明內在狀態誘導的神經啟用和抑制
研究人員繼續使用小鼠水剝奪 （WD） 和飲用水模型來檢測 MEPO（正中對視核）中 PPDH 的變化，MEPO 是水穩態的關鍵區域，以確認 PPDH 是否可以標記行為或內在狀態誘導的神經活動。 在水重新可用之前，將小鼠剝奪水24小時。 結果表明：缺水後MEPO區FOS顯著公升高，恢復飲水1 h後PPDH顯著公升高，飲用8 h後FOS緩慢恢復到基線水平，再次反映了PPDH與FOS標誌物在非動力學方面的差異。
接下來，研究人員測量了缺水下全腦區域的FOS和PPDH水平。 結果顯示，在FOS高表達的最初幾個大腦區域，PPDH顯著降低，這表明：PPDH可以標記與FOS相反方向的神經活動變化。 研究人員開發了用於 PPDH 免疫染色的抗體和操作方法，並且：在10多個大腦區域中，PPDH的顯著降低可以觀察到缺水的顯著變化，但FOS染色的變化則不然，這表明可以通過結合 PPDH 和即時早期基因 （IEG） 來發現一些新的神經底物。
圖6-1 在缺水模型中，PPDH與神經活動呈負相關。
此外，該研究還發現，在禁食和再餵食的小鼠模型中，禁食後的ARC區域顯示出顯著增加的FOS訊號和降低的PPDH訊號。 然而，在重新餵養1小時後，未檢測到FOS訊號的降低，但可以檢測到PPDH訊號的強烈公升高。 綜上所述，這些資料表明：PPDH提供了一種以前未能用現有的基於IEG的活動標誌物組織學標記神經元抑制的方法，並直接證明了使用PPDH跟蹤體內神經元活性降低的可行性。
圖6-2 在食物剝奪模型中，PPDH與神經活動呈負相關。
7.PPDH揭示了與下丘腦外側攝食行為相關的細胞型神經動力學
即刻早期基因（IEGs）已被證明是研究不同大腦區域和神經元型別對各種刺激的反應的有力工具。 研究人員繼續測試PPDH是否有能力揭示研究較少的大腦區域或細胞型別的動力學。
在禁食-再餵養實驗中，下丘腦外側區（LH）的一組離散神經元在禁食後表現出顯著且特異性的PPDH降低，然後在重新餵食後迅速恢復表達，表明這組神經元被禁食啟用，被再餵食抑制。 然而，這種抑制不能通過對 FOS 或其他直接早期基因 （IEG） 的免疫染色檢測到。 研究人員使用PPDH的多種標記物和其他組織學標記物來發現該區域的細胞型別。 最終發現PPDH+神經元與下丘腦分泌素高度重合，但與MCH或VGAT神經元不重合。 這種由禁食-再餵養誘導的細胞型別特異性抑制在HCRT-CRE小鼠中得到驗證，並且與最近關於飲食期間下丘腦分泌素食慾素神經元失活的報道一致。 因此PPDH 可作為標記物來表徵特定的下丘腦分泌素食慾素 LH 細胞群，該細胞群通過禁食啟用，但通過再進食迅速抑制。
圖7 PPDH揭示了與下丘腦外側攝食行為相關的細胞型別神經動力學。
總結
綜上所述，本研究採用光遺傳學技術+磷酸化蛋白質組學篩選，結果顯示丙酮酸脫氫酶E1亞基1（PPDH）的磷酸化與體外和體內培養的神經元的動作電位放電強度呈負相關，即與神經元活性呈負相關。 研究者認證PPDH 可靠地反映了一系列環境中神經元活動的減少，從而將 PPDH 確定為內源性反活動 （IAM） 的第乙個可追溯標誌物。 在未來，PPDH染色可以與全腦透明、成像或掃瞄工具相結合，以改變我們理解活動雙向變化的能力，以更精細的方式研究神經元細胞群，並揭示既定和新正規化背後的神經迴路。
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