1975年，德國學者Kohler和Milstein成功地將骨髓瘤細胞和產生抗體的B淋巴細胞融合成雜交瘤細胞，雜交瘤細胞具有B淋巴細胞只能產生針對特定表位的單轉殖抗體的特徵，也具有腫瘤細胞無限增殖的特性。 雜交瘤技術的誕生開創了抗體生產和使用的新時代。 小鼠雜交瘤單轉殖抗體**穩定，後期易於製備，且得率高，是免疫檢測分析和早期疾病篩查最常用的抗體。 小鼠雜交瘤的製備過程包括以下步驟：抗原鑑定後的製備、動物免疫、血清滴度的測定、滴度達到要求後，脾細胞與骨髓瘤細胞融合，經HAT和HT選擇性培養基篩選和間接酶聯免疫吸附試驗（ELISA）篩選確認後，得到的雜交瘤不僅可以無限增殖， 但也分泌對抗原特異性的雜交瘤抗體。
B細胞富集和篩選
小鼠的淋巴器官由多種型別的細胞組成，包括非B細胞系（40%-60%）和表達Igm的幼稚B細胞（40%-60%）和其他淋巴細胞（<5%），其中任何一種都可以用於融合，但只有表達IgG的B細胞（主要是漿細胞）與骨髓瘤融合才能形成單轉殖抗體分泌雜交瘤細胞， 只有一小部分細胞（02%-5%）表達抗原特異性抗體。傳統的雜交瘤技術是以聚乙二醇（PEG）為融合劑，將脾細胞與骨髓瘤細胞融合，篩選雜交瘤，融合效率低，可以通過篩選和富集漿細胞來提高融合率。
目前，B細胞的分選主要通過流式細胞術完成。 B 細胞可以用 CD45R 免疫磁珠富集，然後進行流式細胞術，用於螢光標記的 CD19 抗體和具有 IgG+ 雙螢光訊號的單個 B 細胞。 液滴微流控還用於抗原特異性單個 B 細胞的分類和封裝。 用這種方法篩選的B細胞活力較差。
融合技術的改進
常規的雜交瘤融合技術主要是在PEG的作用下，將一定比例的小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞融合成雜交瘤細胞。 電融合技術是指在電脈衝場的作用下，將脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞融合成雜交瘤細胞，避免了常規融合技術對化學試劑的汙染。 電融合法產生雜交瘤的效率仍然較低，因為融合前兩個細胞的測序是隨機結合的，特別是當兩個細胞大小差異較大時，測序電壓更容易使大細胞與大細胞接觸，需要融合的兩個細胞的接觸機會減少， 導致聚變效率下降。在電融合前，分別使用生物素和鏈黴親和素標記脾細胞和骨髓瘤細胞，然後將兩個細胞相互配對。 結果表明，用生物素和鏈黴親和素處理脾細胞和sp2 0細胞，增加了兩個細胞之間的接觸機會，降低了相同細胞融合的機會。 因此，改良電融合法製備的雜交瘤數量明顯高於普通電融合法，大大提高了融合效率。 脾細胞也與CPG寡脫氧核苷酸共孵育，然後電熔，這增加了融合速率和產生抗體的細胞數量。
陽性雜交瘤分選
常規的雜交瘤陽性篩查方法是在雜交瘤融合、選擇性培養基和間接ELISA篩選後，採用限制稀釋法獲得單轉殖雜交瘤細胞。 限制稀釋法每次亞轉殖培養時間需要7-10天，需要間接ELISA陽性確認，亞轉殖不能一次獲得單個雜交瘤細胞，需要反覆重複，直到轉殖出單個細胞。 細胞培養既繁瑣又費力，並且可能導致在多次轉殖中丟失其他一些雜交瘤細胞亞型。
晶元篩選
使用晶元進行雜交瘤篩查有幾個優點：一是抗原高靈敏度的測定方法，晶元微孔中細胞的含量相對較小，產生的抗體量也相對較小; 二是晶元體積小，吞吐量高，可以測試大量的轉殖，避免轉殖的丟失; 三是篩選時間，晶元中的雜交瘤占用的空間相對較小，在短時間內需要進行測量和篩選。
微流控篩選
微流控從操作方式上分為流水線微流控和液滴微流控，細胞分選中使用的微流控較多，而液滴微流控主要用於陽性雜交瘤的篩選。 在液滴微流控中分離液滴中的單個細胞，可以進行細胞或分泌蛋白分析，克服了傳統流式細胞術和螢光啟用細胞分選的一些主要限制。 如下圖所示，在乙個50PL的液滴中，螢光探針和塗有抗小鼠IgG抗體的單珠聯合分割單個小鼠雜交瘤細胞，經過15分鐘的細胞培養，單珠捕獲分泌的抗體，當捕獲的抗體與探針結合時，螢光位於珠子上， 產生清晰可辨的螢光，經檢測器鑑定後，分揀出分泌抗體的雜交瘤，丟棄不分泌抗體的雜交瘤。
流式過濾
流式細胞術是以螢光標記的抗原和抗體亞型結合免疫球蛋白為篩選指標，可全自動、快速、高效地篩選抗原特異性和有活力的雜交瘤細胞。 研究人員使用過氧化物酶標記的半抗原與螢光標記的抗過氧化物酶的抗體偶聯物來檢測抗體的特異性，使用螢光標記的抗小鼠IgG抗體來識別抗體分泌，並使用螢光啟用的細胞分選技術將融合混合物中的半抗原特異性單個雜交瘤細胞分選到多孔板中進行培養，這通過直接競爭ELISA檢測方法得到證實。 該方法避免了繁瑣的重複篩選和轉殖過程，為製備其他半抗原特異性抗體提供了參考。
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小鼠雜交瘤單轉殖抗體的開發仍具有挑戰性，當靶向單個結構特異性靶點時，低融合率可能不會影響獲得抗體的最終目的，但對於含有多個靶點的抗原，如致病菌，低融合率可能在篩選和獲得特異性抗體方面起決定性作用。 對於這類多靶點抗原，通常通過測序獲得病原體的序列，通過生物學資訊可以準確獲得病原體的特異性膜蛋白，但仍存在靶點為醣蛋白，醣蛋白空間結構不能**的現象，容易對重組蛋白產生親和力，不能實現理論上含有的病原菌的全覆蓋這個目標。目前，通過抗原特異性B細胞受體的高通量測序，並進行計算、評價和評分，篩選出特異性強、廣譜的單轉殖抗體序列，從而實現預選檢測抗原。
小鼠雜交瘤單轉殖抗體的快速製備技術涉及抗原設計篩選、B細胞富集篩選、腫瘤細胞修飾、融合技術改進、陽性雜交瘤細胞篩選和單轉殖抗體效能快速測定等多個環節。
引用
方水琴、劉成、馬俊飛等 小鼠雜交瘤單轉殖抗體快速製備研究進展[J].中國生物工程學報，2021,37（07）：2293-2306