許多生物分子只在水溶液中具有活性，脫水後，不僅其生物活性變化很大，而且其結構也發生了一定的變化。 因此，溶劑水在活性生物分子的研究中是不可替代的。 水是一種強極性分子，在3400和1640 cm-1區域存在寬而強的紅外吸收帶，水的吸收帶經常與目標生物分子的吸收帶重疊或部分重疊，這使得生物分子的紅外光譜複雜且難度高。 在早期的紅外教科書中，經常有人說“紅外光譜不適合水溶液或水性物質的分析”，說明了水峰干擾的嚴重性。 在許多實踐中，為了獲得目標物質的高質量紅外光譜，必須減去水的紅外吸收峰（干擾峰）。
去除吸水帶的一種方法是用氘代水（D2O）代替水（H2O）作為溶劑。 由於同位素效應，D2O和H2O的IR波段位置存在顯著差異。 然而，活性氫（—Cooh、—NH2 等）存在於許多生物分子中，並且 D2O 中活性氫 （H） 和氘 （D） 之間可以發生交換反應。 一般來說，為確保交換反應完成，D2O溶液必須放置足夠長的時間或經歷多次溶解過程。 氫氘交換可引起一些紅外吸收帶移動，甚至引起生物分子的區域性構象變化。 更嚴重的是，研究蛋白質在水溶液（H2O）中的結構及其生理活性也沒有什麼實際意義，因為D2O中蛋白質的結構可能與H2O中的結構不同。
除了使用D2O溶劑外，光譜減法還廣泛用於減去水峰的干擾。 在該技術中，減去溶液的紅外吸光度光譜AS與溶劑水（或水參比溶液）的吸光度光譜AW之間的光譜差，以獲得減去吸水峰干擾的光譜。 儘管該研究已經開展多年，已成為獲得水溶液紅外光譜的主要手段，但在光譜的重現性和偏差的不確定性方面仍有改進的餘地。
在測量紅外光譜時，通常分別得到被測樣品的單光束光譜（樣品單光束光譜）和參考樣品的單光譜光譜（背景單光束光譜），兩者的比值即為被測樣品的透射光譜。 根據Lambert-Beale定律，如果水在背景光譜和樣品光譜中完全相同，則水的吸收峰不會出現在最終的紅外光譜上。 然而，很難控制參比樣品和待測樣品中水量的一致性。 衰減全反射 （ATR） 附件是目前獲取水溶液紅外光譜的常規方法。 然而，到目前為止，幾乎不可能就參考樣品和使用 ATR 測量技術測量的樣品中有效水分子的總數達成共識。
為了測量紅外光譜，首先測量溶液（K2CO3溶液或BSA溶液）的樣品單光束光譜，然後測量參考樣品的背景單光束光譜。 與傳統的測量方法不同，雙背景樣本用於收集背景光譜。 首先，將空的ATR晶體掃瞄n次（n應足夠大），暫停，用對照品溶液（15%NaCl溶液或純水）填充ATR晶體，繼續掃瞄，觀察紅外光譜圖，可以看到水的吸收峰由強到弱消失的全過程，當獲得無水吸收峰干擾的紅外光譜時停止掃瞄。 實驗路線框圖如圖1所示。
純水的紅外光譜可能與溶液中的水有些不同，包括條帶的位置、吸收峰的形狀等。 因此，在製備參比樣品時，要求參比樣品中水的狀態盡可能與待測樣品中的水的狀態一致。 純水和10%BSA溶液中的水的紅外光譜基本相同，因此在這種情況下使用純水作為參考樣品。 但10%碳酸鉀溶液中水的紅外光譜與純水不同。 據報告，碳酸鉀氯化鈉混合鹽溶液中水的紅外光譜與氯化鈉鹽溶液中的水非常相似，因此，在10%碳酸鉀溶液的情況下，選擇15%氯化鈉溶液作為參考樣品。
當使用單個ATR附件測量時，如果使用空的鍺晶體作為參考樣品，並使用10%碳酸鉀溶液作為待測樣品，則1640 cm-1處水的吸收峰強度約為0075（吸光度）。 若以15%氯化鈉溶液為對照品，同時以10%碳酸鉀溶液為供試品溶液，則在1640 cm-1處出現負而小的吸水峰。 這是因為與15%氯化鈉溶液相比，10%的碳酸鉀溶液含有更少的水。 吸收峰小的原因是兩種溶液的含水量雖然有差異，但很小。
使用不同的參比樣品（空鍺晶體或氯化鈉溶液），水（碳酸鉀溶液）的吸收峰為正負。 那麼，在測量背景光譜時，先用乙個空白的鍺晶體作為參考樣品，多次掃瞄，暫停，然後將15%的氯化鈉溶液填充在鍺晶體上，然後繼續掃瞄，隨著掃瞄次數的增加，會發生什麼？
實驗結果如圖2所示。 1643 cm-1是水的吸收峰，1400 cm-1是碳酸鹽（CO23+）的吸收峰。 在實驗中，首先測量待測樣品的10%K2CO3水溶液的樣品單光束光譜，然後根據上述描述以空白鍺晶體為參考樣品，對背景光譜（空白鍺晶體）進行20次掃瞄，然後暫停。 得到圖2a，其中水的吸收峰（1643 cm-1）為正。 在 1,2 ,...碳酸鹽和水的吸收峰強度在20次掃瞄積累中保持不變。 暫停後，用15%氯化鈉水溶液代替對照樣品，再次掃瞄背景光譜。 隨著新掃瞄的增加，碳酸鹽的吸收強度繼續保持不變（因為15%氯化鈉溶液不含碳酸鹽）。 然而，隨著每次額外的掃瞄，吸水率略有下降（15%氯化鈉大於10%碳酸鉀）。 當氯化鈉溶液掃瞄48次時，1643 cm-1處的水峰明顯變小，如圖2b所示。 每次對氯化鈉水溶液進行額外掃瞄，吸水率峰值都會變小。 當掃瞄次數達到300次時，水的吸收峰已經完全消失，此時停止掃瞄會產生令人滿意的紅外光譜，不受吸收峰的干擾，見圖2c。 該實驗沒有使用差分光譜進行操作。 因此，在實際測量時，縱坐標可以採用吸光度、反射率或透射率等單位。
圖2c顯示了使用ATR技術直接採集紅外光譜，而不會產生水干擾峰。 需要強調的是，兩個參考樣品的掃瞄順序對所獲得的紅外光譜的質量有重要影響。 空白鍺晶體（水0）和10%碳酸鉀溶液的含水量相差很大，而15%氯化鈉溶液和10%碳酸鉀溶液的含水量很小。 因此，將空白的鍺晶體作為第一參考樣品進行掃瞄，使水的IR峰顯示出較大的吸收峰，如圖2a所示。 不難理解，在第二階段，強吸水峰逐漸減小，以達到預期的扣減效果。 如果15%氯化鈉溶液是第乙個參考樣品，則吸水率峰（負）很小，但不可忽略。 在第二階段，弱吸收峰（短時間）消失的過程不利於觀察。 第一參考樣品（空白鍺晶體）的掃瞄次數（n）不宜太小，掃瞄次數n越大，演繹效果越好，也要求積累時間越多。 為了獲得令人滿意的訊雜比，第一參考樣品的掃瞄次數應控制在20至32倍之間。 必須根據所扣除水峰的強度變化實時選擇第二個參考樣品的實際掃瞄次數 m。 其原理是水擾動峰值訊號可以忽略不計，並停止掃瞄。
為了評估新方法對減去水峰的影響，我們將結果與傳統的差分光譜技術進行了比較。 以空白鍺晶體為參考樣品，測得10%碳酸鉀和15%氯化鈉的紅外光譜。 選擇合適的減法係數，減去兩種解的紅外光譜，得到圖3a。
從圖3的比較可以看出，新的雙參考取樣方法（圖3b）效果更好，訊雜比明顯提高，特別是在1640 cm-1範圍內。 雙參考樣品的另乙個優點是易於操作，並可根據需要進行實時監測。 在單ATR附件中，雙參照樣品法成功減去水干擾，效果良好。
雙參考樣品（空白鍺晶體+水），背景光譜包含有關水和空氣的資訊。 所需的背景光譜是關於水層適當厚度的資訊。 雙參比法只有在雙參比樣品的單光束光譜與水的單光束光譜高度相似的情況下才能取得良好的效果。 下文將討論這種方法的侷限性。
圖4顯示了使用雙樣品方法獲得的紅外光譜。 參考樣品都是空氣，要測試的樣品是聚苯乙烯（PS）（圖4a）或雙（聚苯乙烯+空氣）。 圖4a顯示了PS薄膜的紅外光譜，圖4b，c，d和e顯示了雙樣品（聚苯乙烯+空氣）的紅外光譜。 與圖4a相比，圖4b、c、d和e中的光譜均明顯失真。 即，圖4b、c、d和e中的光譜不能代表PS的紅外光譜。 在什麼條件下，空氣和聚苯乙烯樣品的紅外光譜可以與純聚苯乙烯的紅外光譜高度相似？
放大圖4中的2000 1640cm-1區域，得到圖5。 將圖5b、c、d、e中的峰與a中相應的峰進行比較，強度不同，但峰形畸變不明顯。 在2000 1640cm-1區域沒有很強的吸收峰，對紅外光的吸收很小。 因此，紅外峰的吸光度是影響畸變的重要因素。 吸收峰越弱，即吸光度a越小，畸變程度越小。 吸收越強，如圖4所示，帶有星號吸收帶，畸變越嚴重。
可以想象，影響失真的另乙個因素是雙樣本中最終光譜中真實物質（PS）訊號的比例。 M 掃瞄 PS，n 掃瞄空氣，總共 （n+m） 次掃瞄。 當 n 等於零時，它等於 ps 的頻譜，沒有失真。 當M等於零時，得到空氣的光譜，以PS光譜作為判斷標準，畸變最為嚴重。 失真可以用m（n+m）來判斷，當該值等於最大值1時，不失真。 m （n+m） 的值越大（接近 1），從累積頻譜中獲得的失真就越小。
圖 6 顯示了水的 ATR 光譜，即水和空氣的混合 ATR 光譜。 圖6中所有參比樣品均為空白GE晶體，即鍺晶體表面未新增樣品，背景光譜掃瞄32次。 圖6a顯示了水的ATR光譜，採集了64個水樣。 從圖6a可以看出，在3400 cm-1處水的最強峰處，在單次ATR輔助測量中，吸光度約為03.在1640cm-1處的吸光度約為0075。在圖6b中，C和D，通過多次掃瞄水樣和多次掃瞄空ATR晶體來收集樣品，因此圖6b，C和D中的ATR光譜是混合雙樣品（水+空氣）光譜。
混合光譜6b和6a（純水ATR光譜）的峰模式高度相似，如它們之間的差異所示（圖6F）。 m （n+m） = 48 （16+48） = 0.圖6b中75，即對於單個ATR附件測量，只要m（n+m）大於0如圖75所示，所得的混合光譜沒有明顯失真，並且可用於獲得高質量的紅外光譜測量，並消除了水的干擾。 混合光譜 6d， m （n+m） = 025 與水光譜6a相比，存在明顯的畸變，因此圖6a和圖6d之間的差異遠非理想的直線，見圖6h。 在實踐中，只要參比溶液（如15%NaCl溶液）的含水量略高於單個ATR附著的待測溶液（10%碳酸鉀溶液）的含水量，計算表明，這種新方法可以獲得無水峰干擾的高質量紅外光譜。