最近的研究表明，circRNA（circRNAs）在心血管疾病中起著非常重要的作用。 因此，闡明心血管疾病中與circRNA相關的調控機制對於心血管疾病的預防和**至關重要。
2023年2月，加拿大多倫多大學楊伯華教授團隊在research（if=11.0）發表文章“一種新型環狀RNA circitga9 主要在人類心臟病中產生誘導心臟重塑和纖維化”，其中作者發現了32,034個以前未發現的具有不同心臟表達模式的circRNA。值得注意的是，源自整合素-9 circitga9 的 circrna 在心肌肥大患者中顯示出顯著的上調。 CircitGA9 可以通過與原肌球蛋白 3 （TPM3） 結合來調節和誘導肌動蛋白聚合，從而影響心臟組織纖維化。 最後，作者開發了一種靶向 CircitGA9 的封閉寡聚體，可抑制 CircitGA9 和 TPM3 相互作用以改善心臟功能並減少纖維化，該寡聚物可用於進一步的臨床前和轉化開發。 綜上所述，circitga9 水平公升高可驅動心臟重塑和纖維化。 通過將circitga9確定為第乙個靶點，作者為緩解心臟重塑和纖維化的創新干預措施提供了新思路。
首先，作者在心臟病患者或正常人的心臟組織測序和分析中共鑑定了45,284個circRNA，其中13,250個在circbase中已有報道，而其餘32,034個circRNA以前沒有報道過。 GO分析顯示，在涉及11,243個基因的2,900個功能中，有13個達到了顯著水平。 參與這 13 個功能的基因數量為 295 個。 在295個基因中，整合素-9僅出現基因ID ensg00000144668，全部13個功能性狀均出現。 KEGG通路分析顯示，ENSG00000144668參與肥厚型心肌病、擴張型心肌病和細胞粘附分子3條通路，這些通路在心臟重塑中很重要。 有趣的是，在上調的circRNA中，HG38 CIRC 0030600（circitga9）顯著上調，其序列來源於整合素-9的第14和第15個外顯子。 當使用 siRNA 沉默 CircitGa9 時，纖維化相關標誌物的變化（包括成纖維細胞粘附、增殖、轉化生長因子 （TGF-） 表達降低和膠原沉積）最顯著，但心肌細胞活力增加。 此外，73例肥大患者和25例正常心臟標本的circitga9水平明顯高於對照組。 數字液滴PCR結果顯示，與對照樣本相比，患者樣本中CircitGa9的拷貝數顯著增加這表明circitga9在心臟病誘導的纖維化中起著非常重要的作用。
fig 1.circRNA在心臟肥大患者組織中的表達。
為了進一步提高circitga9對心臟功能的影響，作者通過主動脈縮窄（TAC）治療小鼠。 結果顯示，TAC後心臟組織中內源性circitga9水平公升高最多，其次是主動脈和腦組織。 為了研究CircitGa9在心臟功能中的作用，作者構建了人CircitGa9的過表達載體和缺乏環化序列的線性質粒，隨後將奈米顆粒結合的人CircitGA9表達質粒和線性質粒注射到TAC小鼠的腹膜中。 實驗結果顯示，治療8週後，內源性小鼠circitga9和人circitga9在心臟中的表達水平顯著公升高。 使用 VEVO 2100 成像系統進行心臟功能測量發現，與對照組相比，CircitGa9 的過表達導致 TAC 小鼠左心室收縮末期直徑 （LVESD） 和左心室舒張末期直徑 （LVEDD） 顯著增加，而 LVESD-LVEDD 顯著降低。 此外，作者觀察到左心室壓 （DP dt）、左心室射血分數 （LVEF） 和左心室分數 （LVFS） 降低。 M型圖顯示，注射Circitga9表達質粒後TAC的心室收縮減弱，表明與對照組相比，Circitga9過表達組的心臟功能下降。
然後，作者設計了 2 個靶向 circitga9 連線序列的 siRNA。 將siRNA與金奈米顆粒偶聯並送入TAC小鼠體內後，發現儘管TAC後8周心臟中circitga9水平顯著公升高，但siRNA仍降低了circitga9水平。 在TAC小鼠沉默Circitga9的心臟功能測量中，作者檢測到LVESD和LVEDD顯著降低，但LVESD-LVEDD顯示顯著增加。 作者還發現左心室壓、LVEF、LVEF 和 LVFS 顯著公升高。 M 型超聲顯示沉默 CircitGa9 阻止了 TA 誘導的左心室收縮減少。
fig 2.circitga9 的過表達會降低心臟功能。
由於心臟纖維化是與心臟肥厚重塑密切相關的主要結果之一，作者通過用馬松三色和天狼星紅染色心臟組織來觀察膠原蛋白沉積，從而研究了circitga9在心臟纖維化中的作用。 定量分析表明，與對照組相比，TAC小鼠心臟中Masson三色和天狼星紅的染色顯著增加，而注射過表達CircitGA9的遞送進一步增加了TAC小鼠的膠原沉積。 qPCR結果顯示，TAC小鼠I.型和III型膠原蛋白的表達顯著上調，表明Circitga9的過表達進一步提高了心臟膠原水平，導致纖維化增強。 沉默circitga9後，心臟組織中三色馬森紅和天狼星紅水平顯著降低，膠原沉積水平降低。 此外，qPCR結果顯示，這些心臟組織中的I型膠原蛋白和III型膠原蛋白顯著減少。在患者標本中，膠原 I 水平與 circitga9 表達呈正相關，而 circitga9 表達與心臟功能呈負相關。
fig 3.circitga9 對壓力超負荷下心臟纖維化的影響。
為了揭示可能參與介導心臟纖維化中circitga9功能的下游分子，作者檢測到原肌球蛋白3（TPM3）可以通過免疫共沉澱和蛋白質分析與circitga9結合。 為了驗證質譜分析的結果，作者將 CircitGa9 表達構建體和對照載體轉染到 MCF 細胞中，並用 TPM3 抗體捕獲 CircitGa9。 結果顯示，與線性載體相比，CircitGa9過表達組TPM3抗體對CircitGa9的富集度顯著。 此外，使用 CircitGa9 探針對結合蛋白進行下拉檢測，使用 TPM3 抗體對下拉產物進行蛋白質印跡檢測結果表明，CircitGA9可以特異性結合TPM3。
fig 4.CircitGA9 與 TPM3 的結合。
原肌球蛋白在穩定肌動蛋白絲中起著至關重要的作用，原肌球蛋白和肌動蛋白之間的構象變化導致肌動蛋白聚合。 肌動蛋白聚合在調節細胞活性中起重要作用，與組織纖維化密切相關。 因此，作者研究了circitga9和TPM3的結合是否通過調節肌動蛋白聚合來影響心臟纖維化。 實驗結果表明，CircitGA9的過表達促進了MCF細胞中肌動蛋白聚合的增加。 為了進一步闡明與 CircitGa9 功能相關的機制，用 CircitGa9 轉染 HEK-293T 細胞，並使用 TPM3 和肌動蛋白抗體進行免疫共沉澱測定。 結果表明，CircitGa9的表達抑制了TPM3與-Actin的相互作用。 在人心臟組織的原位雜交和免疫螢光染色中，作者觀察到與正常心臟組織相比，肥厚性心臟組織中CircitGa9和F-肌動蛋白的水平公升高，以及Circitga9和TPM3在細胞中的共定位。
為了進一步確認CircitGa9與TPM3的結合活性，作者在結合位點進行了定點誘變，結合位點的突變不影響突變體CircitGa9的環化。 經過免疫共沉澱實驗，發現結合位點突變抑制了TPM3抗體對CircitGA9的富集。 相反，當突變體轉染到 MCF 細胞中時，CircitGa9 探針不能再被呼叫到 TPM3。 隨後，作者對注射**突變載體的TAC小鼠進行了心功能測試，發現LVESD和LVEDD顯著降低，但LVESD-LVEDD顯著增加。 作者還發現左心室壓、LVEF（圖 7f）和 LVFS 顯著增加。 M型超聲顯示，相對於CircitGa9組，CircitGa9對TAC小鼠心臟功能的影響減弱。 綜上所述Circitga9 通過與原肌球蛋白 3 結合來調節肌動蛋白聚合，從而影響心臟纖維化。
fig 5.CircitGA9 通過結合 TPM3 影響心臟功能。
為了探索開發最佳方法的潛力，作者合成了封閉寡核苷酸以阻斷 circitga9 與 TPM3 的結合。 qPCR分析表明，阻斷CircitGa9結合位點可顯著降低CircitGa9與TPM3的結合。 M型圖顯示，阻斷CircitGA9與TPM3的相互作用後，TAC心臟左心室收縮功能增強。 在注射封閉寡聚物的TAC小鼠的心臟功能測量中，作者觀察到LVEDD和LVESD顯著降低，LVESD-LVEDD顯著增加。 作者還檢測到左心室壓顯著增加，LVFS和LVEF顯著增加，表明TAC小鼠的心臟功能得到改善。
此外，在給予封閉寡聚物的TAC小鼠心臟切片中，Marson三色和天狼星紅染色顯示出染色水平和膠原沉積水平降低。 qPCR檢測顯示心臟組織中的I.型膠原和III型膠原顯著減少。 在細胞活力測定中，作者發現轉染阻斷寡聚體降低了原代分離的心臟成纖維細胞的存活率、粘附性和遷移率。
fig 6.阻止 circitga9 的作用。
總之，在本文中，作者證明了circitga9與TPM3和-肌動蛋白形成複合物，促進肌動蛋白聚合，從而調節心臟纖維化。