首先，我們收穫細胞或組織並製備單細胞懸浮液。 然後，我們將單細胞懸浮液轉移到 96 孔板、管或聚苯乙烯圓底管中，具體取決於所用細胞的數量和體積。
所需材料：
細胞懸浮液聚苯乙烯圓底 12 75 mm2 Falken 管，裝在 96 孔板（或與您的離心機相容的任何容器）中。
懸浮液洗滌緩衝液（PBS，5-10%胎兒細胞血清（FCS））。
可選紅細胞裂解緩衝液（例如，R377982）。
第 1 步
大約需要20分鐘。
根據指南收穫和洗滌細胞。
1.1 對於血液樣本，我們建議將樣本與紅細胞裂解緩衝液（例如R377982）一起孵育。
提示 1：紅細胞裂解緩衝液裂解紅細胞，這可能會干擾白細胞（有核細胞）的分析。
提示 2：通過避免氣泡、劇烈渦旋、在緩衝液更換期間吸入整個溶液以及過度離心來防止細胞損傷。
確定細胞總數並檢查細胞活力。
2.1 一般來說，成活率應為90-95%。
離心並將細胞樣品重懸於冰冷的懸浮緩衝液中。
3.1.在4°C下以約200g離心5分鐘，32 推薦懸浮細胞濃度：05 1 106 細胞毫公升。
提示：旋轉時間和速度可能需要優化。 一般來說，細胞應充分離心以除去上清液，但為了不引起細胞損失，離心力不宜過強，以防止細胞難以復活。
警告：較高的細胞濃度可能會堵塞流式細胞術系統並影響解像度。
繼續用活性染料染色。
由於死細胞容易與抗體發生非特異性結合，因此將這些細胞排除在分析之外非常重要。 使用活性染料使我們能夠區分活細胞和死細胞，並在資料採集和分析過程中排除死細胞。
DNA 結合染料（例如 7-AAD、DAPI 和 TOPRO3）通常用作活性染料，用於對活細胞中的死細胞進行染色，因為它們無法穿透活細胞的細胞膜。 死細胞中受損的細胞膜使這些染料與 DNA 接觸、與 DNA 結合並發出螢光。
但是，這些染料不能用於固定細胞的活死染色，否則所有細胞的細胞膜都會受到損害。 在這種情況下，我們必須使用胺反應性可固定細胞活力染料。
所需材料：
活性染料。 不可固定染料示例：7-AAD、DRAQ-5、DRAQ-7 或 DAPI
可固色染料。
懸浮液：洗滌緩衝液（例如，PBS、5-10% 胎兒細胞血清 （FCS））。
第 1 步
用活染料對細胞進行染色。
1.根據製造商的說明，在4°C下在黑暗中用染料孵育細胞。
注意：將螢光基團置於黑暗中，以避免光漂白。
提示：選擇其發射光譜與用於免疫染色的螢光團不重疊的染料。
用洗滌緩衝液洗滌細胞兩次。
2.向下旋轉細胞（200g，5分鐘，4°C），除去上清液，並在每次洗滌後重懸沉澱。
提示：洗滌步驟數、脫水時間和速度可能需要優化。 當使用過量的洗滌緩衝液並在離心後盡可能多地去除液體時，乙個洗滌步驟可能就足夠了。
檢測到細胞外靶標時繼續阻斷，或細胞內靶標的固定和透化。
當對細胞內靶標進行染色時，我們必須執行額外的固定和透化步驟。 保留細胞內蛋白質的結構需要固定。 透化會破壞細胞膜，使抗體進入細胞並染色細胞內靶標。
當對細胞外靶標進行染色時，我們將立即進行封閉步驟。 當同時分析細胞內和細胞外靶標時，我們需要在固定和透化之前進行細胞表面染色（見第 5 階段）。
選擇正確的細胞內染色固定和透化方法的有用提示：
靠近質膜的抗原和可溶性細胞質抗原需要輕度的細胞通透，無需固定。
細胞骨架、病毒和某些酶抗原在用高濃度丙酮、酒精或甲醛固定時通常產生最佳效果。
細胞質細胞器和顆粒中的抗原是否需要固定和透化方法取決於抗原。
表位需要保持可訪問性。
所需材料：
細胞懸浮液。 懸浮緩衝液（PBS，5-10%FCS）。
固定劑（例如，1-4% 多聚甲醛、90% 甲醇或丙酮）。
透化溶液（例如，Triton X-100、NP-40 或皂苷）。
或者，您可以使用適用於大多數樣品型別的流式細胞術固定和透化試劑盒。
第 1 步
大約需要 1 小時 15 分鐘。
用您選擇的固定劑固定細胞。
1.1將細胞離心成沉澱（200g，5分鐘，4°C），棄去上清液，並將沉澱重懸於固定劑中。
1.2 將細胞與固定劑一起孵育，如下所示。
提示：需要針對不同的抗原優化固定。 一些表位對甲醇非常敏感，所以如果測試有任何問題，請嘗試丙酮。
定影劑。 時間。
1-4%多聚甲醛（PFA）。
在冰上15-20分鐘。
90% 甲醇。
20°C10分鐘。
100% 丙酮*
在冰上10-15分鐘。
聚苯乙烯塑料管不適合與丙酮一起使用。
用懸浮緩衝液洗滌細胞兩次。
2.1離心細胞（200g，5分鐘，4°C），棄去上清液，重懸於洗滌緩衝液中。
提示：可以優化洗滌步驟的數量、脫水時間和速度。 當使用過量的洗滌緩衝液並在離心後盡可能多地去除液體時，乙個洗滌步驟可能就足夠了。
通過用合適的洗滌劑孵育細胞來透化細胞。
3.1將細胞離心成沉澱（200g，5分鐘，4°C），棄去上清液，重懸於洗滌劑溶液中。
3.2 在室溫下將細胞在洗滌劑中孵育 10-15 分鐘。
注意：如果使用丙酮作為固定劑，則不需要此步驟，因為丙酮也可以透化細胞。
提示 1：最佳洗滌劑的選擇取決於蛋白質及其定位。 強力去汙劑（如Triton或NP-40）可部分溶解核膜，因此適用於核抗原染色。 相比之下，溫和的去汙劑，如吐溫 20 或皂苷，使抗體能夠在不溶解質膜的情況下通過孔隙，這使得它們適用於細胞質或質膜細胞質表面的抗原和可溶性核抗原。
提示 2：洗滌劑的濃度應根據您的樣品進行優化。 提示 3：透化會影響流式細胞儀上細胞的光散射曲線; 在檢測和資料分析期間（第 6 階段）對細胞群進行門控時，請記住這一點。
用懸浮緩衝液洗滌細胞兩次。
4.1離心細胞（200g，5分鐘，4°C），棄去上清液，重懸於洗滌中緩慢沖洗。
提示：洗滌步驟數、脫水時間和速度可能需要優化。 當使用過量的洗滌緩衝液並在離心後盡可能多地去除液體時，乙個洗滌步驟可能就足夠了。
執行後續阻止步驟。
阻斷蛋白質和 Fc 結構域對於防止抗體與細胞的非特異性結合至關重要。
所需材料：
材料的選擇取決於所分析細胞的型別，如果適用，還取決於所使用的二抗
FCR 阻斷緩衝液（例如，2-10% 山羊血清、人 IgG 或小鼠抗 CD16 CD32）。
懸浮緩衝液（PBS，5-10%FCS）。
第 1 步
大約需要45分鐘。
用封閉緩衝液阻斷FC受體。
1.1將細胞離心成沉澱（200g，5分鐘，4°C），棄去上清液，重懸於封閉緩慢沖洗中。
1.將細胞與緩衝液在 4°C 的黑暗中孵育 30-60 分鐘。
用洗滌緩衝液洗滌細胞兩次。
2.向下旋轉細胞（200g，5分鐘，4°C），除去上清液，並在每次洗滌後重懸沉澱。
提示：洗滌步驟數、脫水時間和速度可能需要優化。 當使用過量的洗滌緩衝液並在離心後盡可能多地去除液體時，乙個洗滌步驟可能就足夠了。
繼續進行抗體孵育。
我們現在已經準備好用螢光團偶聯抗體對細胞進行染色，以便在流式細胞術中進行間接或直接檢測。
以下程式也可以重複並應用於多色流式細胞術，其中多組螢光團偶聯抗體用於對抗不同的靶標。 當使用多組抗體時，我們應該儘量減少螢光團發射光譜的重疊。
直接抗體標記
所需材料：
偶聯成一種抗體。 示例 （05-1細胞懸液106ml）。
懸浮緩衝液（PBS，5-10%FCS）。
第 1 步
時間大約是40分鐘。
在懸浮緩衝液中稀釋結合的一抗。
1.1 每種抗體的推薦稀釋度通常在資料表上提供。
提示：通過連續稀釋滴定抗體將幫助您找到最適合實驗的抗體濃度。
在預稀釋的一抗中孵育細胞。
2.離心細胞（200g，5分鐘，4°C），棄去上清液，並將細胞重懸於抗溶液中。 2.在2°C和4°C下在黑暗中孵育20-30分鐘。 固定細胞可在室溫或4°C下孵育。
提示：此步驟可能需要優化。
注意：將螢光基團置於黑暗中，以避免光漂白。
用懸浮緩衝液洗滌細胞兩次。
3.離心細胞（200g，5分鐘，4°C），除去上清液，每次洗滌後重懸。
3.2 提示：洗滌步驟數、脫水時間和速度可能需要優化。 當使用過量的洗滌緩衝液並在離心後盡可能多地去除液體時，乙個洗滌步驟可能就足夠了。
盡快進行流式細胞術檢測。
4.1 如果在抗體染色後（1 小時內）未立即在流式細胞儀中分析細胞並且未預先固定，則可以在此步驟（1-4% PFA，4°C，20 分鐘）固定染色的細胞。 固定有助於將細胞儲存數天，穩定光散射，並使大多數生物危害劑失活。 控制項需要使用相同的程式固定。 請注意，固定會殺死細胞，並且與不可固定的細胞活力染料不相容（如果這些染料以前使用過）。
提示：孵育後立即獲得最佳結果。
警告：如果您打算實時研究細胞，請不要修復它們。
4.2 固定後洗滌細胞3次，並將細胞懸液儲存在懸浮緩衝液中。
4.3 按照使用說明進行操作。
提示：將細胞儲存在深色冰上或4°C冰箱中，直到您預定的分析時間。
間接抗體標記
間接標記需要兩個孵育步驟，首先是一抗，然後是相容的二抗。 二抗（而非一抗）與螢光染料（FITC、PE、Cy5 等）偶聯。
所需材料：
一抗。 偶聯二抗。
示例 （05-1細胞懸液106ml）。
懸浮液洗滌緩衝液（PBS，5-10%FCS）。
第 1 步
時間約為1小時15分鐘。
在懸浮緩衝液中稀釋一抗和二抗。
1.1 每種應用的推薦稀釋度通常在抗體資料表上提供。
提示：通過連續稀釋滴定抗體將幫助您找到最適合實驗的抗體濃度。
在預稀釋的一抗中孵育細胞。
2.1離心細胞（200g，5分鐘，4°C），棄去上清液，重懸於一抗溶液中。
2.在2°C和4°C下在黑暗中孵育20-30分鐘。 固定細胞可在室溫或4°C下孵育。
提示：孵育時間可能需要優化。
用懸浮緩衝液洗滌細胞兩次。
3.每次洗滌後，旋轉細胞（200g，5分鐘，4°C），除去上清液並重懸沉澱。
提示：洗滌步驟數、脫水時間和速度可能需要優化。 當使用過量的洗滌緩衝液並在離心後盡可能多地去除液體時，乙個洗滌步驟可能就足夠了。
在預先稀釋的二抗中孵育細胞。
4.1離心細胞（200g，5分鐘，4°C），棄去上清液，並將沉澱重懸於二抗溶液中。
4.2 在黑暗中孵育 20-30 分鐘 重要的是要將螢光團保持在黑暗中以避免光漂白。
用洗滌緩衝液洗滌細胞兩次。
5.1將細胞離心成沉澱（500g，5分鐘，4°C），棄去上清液，並重懸於洗滌緩衝液中。
提示：洗滌步驟數、脫水時間和速度可能需要優化。 當使用過量的洗滌緩衝液並在離心後盡可能多地去除液體時，乙個洗滌步驟可能就足夠了。
盡快進行流式細胞術檢測。
6.1 如果在抗體染色後（1 小時內）未立即在流式細胞儀中分析細胞並且未預先固定，則可以在此步驟（1-4% PFA，4°C，20 分鐘）固定染色的細胞。 固定有助於將細胞儲存數天，穩定光散射，並使大多數生物危害劑失活。 控制項需要使用相同的程式固定。 請注意，固定會殺死細胞，並且與不可固定的細胞活力染料（如果以前使用過）不相容。
提示：孵化後立即獲得最佳效果。
警告：如果您打算實時研究細胞，請不要修復它們。
6.2 固定後洗滌細胞3次，並將細胞懸液儲存在懸浮緩衝液中。
6.3 按照說明進行資料收集。
提示：將細胞儲存在深色冰上或4°C冰箱中，直到您預定的分析時間。
抗體孵育後，我們可以在流式細胞儀中進行實驗。 該過程很大程度上取決於所使用的裝置，因此請務必先與製造商聯絡。
當表面染色的細胞存活且未固定或透化時，可以使用螢光啟用細胞分選 （FACS） 分離它們。 使用FACS，活細胞可以根據其特徵分組到不同的群體中。 然後，我們可以對分離的細胞進行下游分析。
欲瞭解更多資訊，請訪問我們的網站，該網站旨在幫助您從細胞中獲取最佳資料。