自 1979 年首次發表描述蛋白質印跡的出版物以來，這種免疫檢測技術已廣泛用於改變從細胞或組織中提取的複雜混合物中的特定蛋白質。 蛋白質印跡有三個基本要素：1 按大小分離蛋白質，2 轉移到固體支援物，3 用適當的一抗標記目標蛋白質，然後視覺化（通常使用偶聯的二抗）。 隨後工具和技術的改進，以及高靈敏度螢光標記物的發展，有效地提高了檢測限，使科學家能夠探測組織特異性的正常和疾病。 然而，科學家在使用定量蛋白質印跡法來識別蛋白質水平的變化時經常會遇到一些困難。 這是因為許多蛋白質在組織中以及在不同的生理和病理條件下表現出不同的表達模式。
雖然蛋白質印跡可能是最常用的免疫學應用，但仍有一些關鍵的技術問題可能被忽視了很長時間。 例如，分離或分離方案是否會影響蛋白質的完整性或其翻譯後修飾？是否有可能區分蛋白質的解釋或聚集與生物過程的相關產物當結果是多個波段時，如何確定哪些是結果、變化、偽影？
定量蛋白質印跡法可用於比較一組樣品中靶蛋白的相對量，這些樣品可以代表不同的個體、條件、疾病狀態或其他生物學變數。 為了準確識別和測量多個樣品中的總蛋白水平，科學家可以使用“上下對照”作為內標。 該對照是指新增針對蛋白質的一抗，該蛋白質假定存在於所有樣品中，並且其相對豐度不受生物學變異或實驗條件的影響。 蛋白質靶標通常是上樣對照的良好候選者，它們是普遍表達的“管家”基因產物。 假設不同樣品通道之間的上樣量控制相同，則上樣控制可用於量化所有孔中的樣品量，以標準化結果。 使用上樣控制還可以防止“邊緣效應”，這在使用大量泳道時很常見，並且外泳道中的蛋白質轉移到更靠近框架的塗片中，從而導致泳道上的染色更強烈。 上樣對照可用於顯示上樣蛋白量是否發生變化，並解釋目標條帶中觀察到的變化。 如果使用得當，上樣對照可確保蛋白質得到正確定量，儘管蛋白質印跡所有泳道的上樣量略有不同。
肌動蛋白和微管蛋白已被用作上樣對照，因為它們的表達在大多數模型系統中是相對組成型的。 然而，一些出版物質疑使用肌動蛋白作為標準負荷對照，理由是肌動蛋白和微管蛋白水平組織之間存在差異，並且它們的表達可能受到病理條件的影響。 這些作者建議將總蛋白分析作為定量蛋白質印跡的替代技術，並建議在研究所研究基因表達模式後應謹慎使用“管家”基因產物。 儘管如此，肌動蛋白和微管蛋白作為內控抗體具有一定的優勢：它們高度保守，表達水平高，並且在大多數實驗條件下表現出良好的穩定性。 需要注意的是，必須根據所研究的特定組織或細胞型別來選擇對照，並且可能需要經驗測試來驗證上樣對照的均勻性。
為了克服蛋白質印跡的變異性並減少資料解釋中的錯誤，以下一些預防措施可能會有所幫助。
採用表達穩定、受實驗條件影響最小的內部上樣對照。
選擇針對樣品組成行中已知表達的蛋白質的上樣對照抗體。
第二個載入對照用於確認從第乙個對照獲得的結果。 它對於新的或新穎的樣品特別有價值。
上樣對照應涵蓋較寬的分子量範圍，以便所選對照與目標蛋白的分子量相似。 這確保了在印跡上可以輕鬆區分目標條帶和對照條帶。
上樣對照抗體通常可檢測大量表達的管家蛋白，導致訊號飽和，尤其是在使用化學發光檢測方法時，過飽和可能導致上樣對照條帶無法作為參考，並可能隱藏目標蛋白量的樣品間差異。
引用
1. renart j, reiser j, stark gr. 1979. transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-**and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.. proceedings of the national academy of sciences. 76(7):3116-3120.
2. dittmer a, dittmer j. 2006. βactin is not a reliable loading control in western blot analysis. electrophoresis. 27(14):2844-2845.
3. eaton sl, roche sl, ll**ero, hurtado m, et al. total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent western blotting. plos one. 8(8):e72457.
4. li r, shen y. 2013. an old method facing a new challenge: re-visiting housekeeping proteins as internal reference control for neuroscience research. life sciences. 92(13):747-751.
5. gorr ta, vogel j. 2015. western blotting revisited: critical perusal of underappreciated technical issues. prot. clin. appl.. 9(3-4):396-405.