1、操作前的準備：
1.75 用酒精擦拭生物安全檯面並設定廢物箱。 除去所需的培養基，PBS，胰酶。
以此類推提前熱身;
2.開啟紫外線燈照射超淨工作台15-30min;
3.關閉紫外線燈並開啟鼓風機 5 分鐘
4.戴上手套，用75酒精擦拭，用75酒提前預熱培養基、PBS、胰酶等。
精細擦拭後，放在生物安全櫃的工作台上。
2、細胞回收（慢速冷凍、瞬間溶解原理）：
1.提前開啟37水浴，確保細胞復甦時水浴溫度能達到37
2.從液氮中取出細胞;
3.迅速放入37水浴中，1min內熔化，用75酒精擦拭凍存管，放入生物安全櫃中。
在工作台上;4.開啟中型瓶蓋（開啟蓋子前用酒精棉籤擦拭蓋子的邊緣），將培養基瓶放在瓶架上，然後蓋上蓋子。
放置在“非工作區域”，避免工作時受到汙染;
5.再次使用一次性巴斯德移液管或移液管將5ml新鮮的完全培養物分配到新的15ml離心管中。
用移液管吸出凍存管中的細胞懸液，滴加至離心管中，以1500rpm離心3min
6.棄去上清液，根據冷凍儲存時的細胞數選擇適當體積新鮮的合適培養皿。
將細胞沉澱重懸於完全培養物中，並將細胞沉澱轉移到乾淨的培養皿中，充分混合，然後進行顯微鏡檢查。
在顯微鏡下觀察細胞狀態;
7.將其放入37,5%CO 2培養箱中，第二天觀察細胞的存活和狀態，並更換液體（是的。
一些比較特殊的細胞粘附速度較慢，餵食時間取決於情況）。
8.收集培養基等，用75%酒精擦拭手術台，關閉生物安全櫃
9.沖洗廢液箱。
3.貼壁細胞的傳代培養：
1.開啟培養皿（瓶）的蓋子（蓋子放在“非工作區”，培養皿的蓋子和口不能接觸任何東西），以一定角度吸出所有培養基
2.加入適當的PBS沖洗（建議蓋住盤子（瓶）的底部），並以一定角度吸出PBS
3.加 05ml-1ml胰蛋白酶溶液，混勻，均勻覆蓋細胞，放入37細胞培養箱中消化。
1-2min（部分細胞難以消化，故適當增加消化時間）;
4.在顯微鏡下觀察細胞，細胞的細胞質回縮，細胞不再連線成片狀，說明消化適中;
5.立即加入新鮮的完全培養物以終止消化，並用移液管或移液管小心地移液以與細胞形成懸浮液充分混合。
移液器進入新的15ml離心管;
6.以1,500rpm離心3分鐘，棄去上清液，加入適當體積的新鮮完全培養基，並用移液管輕輕吹氣。
打動細胞懸液，按比例傳代，然後將細胞懸液分配到新的培養瓶（培養皿）中並補足懸浮液。
足夠的完全培養基;
7.充分混合並在 37.5% CO2 培養箱中孵育;
8.收集培養基、胰酶等，用75%酒精擦拭手術台，關閉生物安全櫃
9.沖洗廢液箱。
4.懸浮細胞的傳代培養：
1.直接傳代：
1）開啟培養皿（瓶）的蓋子（蓋子放在“非工作區”，培養皿的蓋子和口不能接觸任何物品）;
2）按傳代比例加入適量的新鮮完全培養基，小心吸取細胞懸液，再次按壓。
根據傳代比例，分裝到新的培養皿（瓶）中;
3） 蓋上蓋子，充分混合，放入 37,5% CO2 培養箱中進行培養。
2.離心傳代：
1）開啟培養皿（瓶）的蓋子（蓋子放在“非工作區”，培養皿的蓋子和口不能接觸任何物品）;
2）用移液管或巴斯德移液管將細胞懸液吸入新的15ml離心管中;
3）以1500rpm離心3min，棄去上清液，加入適量的新鮮完全培養基，用移液管輕輕吹氣。
打動細胞懸液，按比例傳代，然後將細胞懸液分配到新的培養瓶（培養皿）中並補足懸浮液。
足夠的完全培養基;
4）蓋上蓋子，攪拌均勻，放入37.5%CO2培養箱中孵育;
3.收集培養基、胰酶等，用75%酒精擦拭手術台，關閉生物安全櫃
4.沖洗廢液箱。
5.半貼壁細胞的傳代培養：
1.開啟培養皿（瓶）的蓋子（蓋子放在“非工作區”，培養皿的蓋子和口不能接觸任何物品）;
2.用移液管或巴斯德移液管吸取培養皿（燒瓶）壁，以分離半貼壁細胞（如果。
細胞粘附比較牢固，可參照貼壁細胞的消化方式進行消化）。
3.用移液管或巴斯德移液管將細胞懸液移入新的15ml離心管中;
4.以1,500rpm離心3分鐘，棄去上清液，加入適當體積的新鮮完全培養基，並用移液管輕輕吹氣。
打動細胞懸液，按比例傳代，然後將細胞懸液分配到新的培養瓶（培養皿）中並補足懸浮液。
足夠的完全培養基;
5.蓋上蓋子，充分混合，然後放入 37.5% CO2 培養箱中孵育;
6.收集培養基、胰酶等，用75%酒精擦拭手術台，關閉生物安全櫃
7.沖洗廢液箱。
6.冷凍儲存：1步驟4 對貼壁細胞進行傳代培養（避免消化時間過長，否則會影響凍存質量）。
2.立即加入新鮮的完全培養基以終止消化，並小心地移液以將細胞形成懸浮液與移液管或移液管混合。
移液器進入新的15ml離心管;
3.以1500rpm離心3分鐘，棄去上清液，加入預先製備的凍存溶液，並調節細胞密度（每次冷凍儲存。
冷凍細胞懸液1ml，每管細胞數約5 106），並在凍存管上清楚地標明細胞名稱
代數、凍存時間和凍存人員的姓名首字母;
4.將小瓶放入程式冷卻箱中，轉移到-80冰箱中過夜，然後轉移冷凍儲存的細胞。
以液氮，長期貯存;
注：完全培養基：90%基礎培養基10%FBS 1%雙特異性抗體溶液（部分培養基還需要新增谷氨醯胺。
醯胺類、丙酮酸鈉、非必需氨基酸等，具體培養基的配置參照中科院公式）。
凍存液：90胎牛血清10 dmso
注意：無菌處理的關鍵是任何可能與細胞接觸的物品都無法到達未滅菌的物品。
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