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產生甘油的念珠菌25S RNA甲基轉移酶BMT5對乙酸脅迫耐受性的影響及其應用
作者：
劉周1,2， 盧新耀1,2， 宗紅1,2， 朱戈斌1,2*
單位：
1 江南大學工業生物技術教育部重點實驗室。
2 江南大學生物工程學院工業微生物與多元醇研究設計中心。
**專案：
國家自然科學計畫（22278187）。
摘要>關鍵詞
總結：挖掘功能基因和提高菌株對環境脅迫的耐受性對於有效利用纖維素水解產物生產乙醇至關重要。 念珠菌甘油素是一種具有多重抗逆性的工業菌株，通過基因組文庫篩選獲得RNA甲基轉移酶基因CGBMT5。 CGBMT5在釀酒酵母中的表達提高了對乙酸的耐受性，脅迫下重組菌的乙醇得率為605 g l，增加 177%。在 cCGBMT5在甘油原中過表達後，乙醇產量增加176%，兩種過表達細胞的產量、底物轉化率和生產強度均得到改善。 此外，C將甘油素過表達菌應用於纖維素水解產物發酵，乙醇收率提高71轉化率提高 7% 和 65%0%，生產強度增加1557%。在醋酸脅迫下，過表達細菌中脂質過氧化水平降低，過氧化氫酶（過氧化氫酶）和超氧化物歧化酶（SOD）活性增加。 轉錄分析表明，PFK1和ARG3基因上調，GPD1和CoX3基因下調，提示CGBMT5可能通過降低脂質過氧化水平、增加SOD和CAT活性、影響葡萄糖代謝和精氨酸合成來促進菌株的乙酸耐受性和發酵能力。 本研究為酵母的脅迫耐受機制和纖維素乙醇技術的發展提供了新的生物材料。
關鍵字：產生甘油的釀酒念珠菌; 基因篩查; 環境壓力; 纖維素水解產物; RNA甲基轉移酶。
主要結論：
1.CGBMT5對釀酒酵母耐醋酸及發酵效能的影響
經過基因組文庫篩選和測序比較，獲得了促進乙酸耐受性的基因CGBMT5。 與對照細菌（s.）釀酒酵母 p414-kan）。Cerevisiae P414-kan-CGBMT5在85 mmoll L乙酸下生長較好（圖1-A），滯後期縮短約12 h，乙醇產率為60 h5 g l，增加 177%；每個晶胞的乙醇產率129 克公升，27 公升7%；轉化率 416%，同比增長17%8%，生產強度提高176%，生物量無顯著變化（圖1-b）。 這些結果表明，CGBMT5可以改善醋酸脅迫下釀酒酵母的生長和乙醇發酵效能。
A-85 mmolL醋酸點板應力結果; 乙醇發酵效能 B-85 mmoll l 醋酸脅迫。
圖1 CGBMT5 與 S釀酒酵母對醋酸耐受性和發酵效能的影響。
figure 1 effects of cgbmt5 on acetic acid tolerance and fermentation performance of s. cerevisiae
2.CGBMT5 對 C 的過表達甘油素脅迫耐受性的影響
120 mmol乙酸在C中應激CGBMT5在甘油原中過表達，過表達菌株滯後時間縮短24 h，乙醇得率為62 h7 克公升，增加 176%，每晶胞乙醇收率為123 g l，增加 171%；轉化率 461%，增加176%；生產強度增加477%，最終生物量無顯著差異（圖2-a）。 結果表明，在CGBMT5在甘油原中的過表達改善了120 mmoll 乙酸脅迫下的乙醇發酵效能。
甘油是乙醇發酵的副產品，收率為51 g l，1 單位細菌甘油產量0 g l，與對照無顯著差異，生產強度增加205%（圖2-b）。 結果表明，在醋酸脅迫下，CGBMT5的過表達不能增加菌株甘油的積累。
a- c.甘油劑乙醇發酵; 甘油產量，b-乙醇發酵的副產品。
圖2 CGBMT5的過表達與C的關係甘油素對乙醇發酵效能的影響。
fig.2 effect of overexpression of cgbmt5 on the ethanol fermentation performance of c. glycerinogenes
為探究過表達菌株耐酸的機制，進一步分析了過表達菌株的細胞膜脂質過氧化水平以及CAT和SOD的酶活性（圖3）。 在正常條件下，對照菌株和過表達菌株之間的脂質過氧化水平相似。 然而，在醋酸脅迫下，過表達菌株的脂質過氧化水平降低181%（圖3-A），表明CGBMT5可以通過降低過表達菌株中的膜脂質過氧化水平來調節細胞以應對乙酸應激; 過表達菌株的CAT和SOD活性分別為9%2 U mg 蛋白質，347 u mg 蛋白質（圖 3-b），增加 736% 和 535%，表明CGBMT5過表達後菌株耐乙酸性的變化與抗氧化酶活性的增加有關。
a-c.甘油素脂質過氧化水平; b-c.甘油素過氧化物酶活性。
圖3 CGBMT5的過表達與C的關係甘油素、脂質過氧化水平和過氧化物酶活性的影響。
fig.3 effect of overexpression of cgbmt5 on lipid peroxidation level and peroxidase activity of c. glycerinogenes
注：圖中的應力條件均為120 mmol l乙酸。
為研究CGBMT5對菌株細胞內代謝的調控機制，檢測甘油-3-磷酸脫氫酶基因（GPD1）、鳥氨酸氨基甲醯轉移酶基因（ARG3）、質膜P2 H+-ATPase基因（PMA1）、磷酸果糖激酶基因1（PFK1）和細胞色素C氧化酶亞基基因（COX3）的轉錄水平。 在乙酸脅迫下，這些基因部分上調（圖4），其中Arg3的轉錄水平增加了4糖酵解途徑的關鍵酶基因PFK1上調8倍5次。 這些結果表明，CGBMT5的過表達可能影響上述酸脅迫反應基因的轉錄。
圖4 乙酸耐受相關基因的轉錄水平。
fig.4 transcription levels of genes related to acetic acid tolerance
3.過表達菌株用纖維素水解產物發酵乙醇
CGBMT5過表達菌株C將甘油素δura5 purgap-cgbmT5應用於纖維素水解產物中發酵乙醇，過表達菌株生長優於對照，生物量增加676%；乙醇生產 218 g l，增加了 717%；每個晶胞的乙醇產量29 克公升，26 公升1%；轉化率為363%，同比增長65%0%，生產強度增加1557%。總之，在 CCGBMT5在甘油素菌株中的過表達可以顯著提高菌株對多種脅迫和複雜環境的耐受性，從而提高纖維素水解產物的乙醇發酵效能。
圖5 用乙醇、纖維水解物發酵過表達CGBMT5菌株。
fig.5 cgbmt5 overexpressed strain ferments ethanol with fiber hydrolysateh
本研究證實，CGBMT5 通過影響過氧化物酶 SOD 和 CAT 的活性以及影響 C 來減輕 ROS 對細胞造成的損害甘油原δura5酸脅迫反應基因PFK1、GPD1、COX3和ARG3的轉錄通過促進細胞內精氨酸合成途徑和上調磷酸果糖激酶PFK1，提高了菌株對乙酸的耐受性和乙酸脅迫下的乙醇發酵效能，提高了纖維素水解產物乙醇的晶胞產量和底物轉化率，為酵母脅迫耐受性的研究和開發提供了新的生物材料纖維素乙醇技術。
認識團隊。 江南大學工業微生物實驗室是由老一輩科研人員建立和發展起來的，是我國最早開展工業微生物技術研究的單位之一（1963年）。 主要研究方向為工業酵母念珠菌甘油素的抗逆機理、底盤改性及其在高附加值化學品合成中的應用。 課題組先後獲得“國家發明二等獎”、“中國輕工業科技進步一等獎”、“中國糧油學會科學技術獎一等獎”、“中國商業聯合會科技進步一等獎”。
組長
諸葛斌，江南大學生物工程學院教授、博士生導師，主要研究方向為工業酵母的抗逆機理及底盤應用。 江蘇省“六大人才峰”高層次人才，先後獲得國家、省部級科技進步一等獎3項、三等獎1項、市級1項，出版國內外學術期刊近200種，主編、副主編或合編5部（國家“十一五”規劃2項），發明專利21項。 主持自然**等國家級專案6項，省部級專案3項，市級、企業專案多項。
引文格式
劉周、盧心瑤、宗紅等 甘油念珠菌25S RNA甲基轉移酶BMT5對乙酸脅迫耐受性的影響及其應用[J].食品與發酵工業，2024,50（01）：1-6.
*供稿 |作者：