文章介紹
2024年1月24日，荷蘭研究學者在《華爾街日報》上advanced healthcare materials（if:9.9995）發表了一篇題為“使用樂高類積木的模組化微流體類器官平台”的研究文章。
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總結。 abstract
鑑於目前3D體外模型的侷限性，有必要補充：類器官和器官晶元 （OOC）。技術正在融合。 然而，將類器官摻入標準OOC的過程面臨許多技術挑戰，例如繁瑣的處理、缺乏靈活性，並可能導致複雜和低效的細胞培養方案。 因此，開發專門適配且更靈活的微流控平台有助於實現複雜3D體外模型的高效整合。 本研究開發了一種模組化、無管流體電路板（FCB）與可逆封裝細胞培養磚相結合，用於胚胎幹細胞（ESC）來源的甲狀腺濾泡的動態培養。 甲狀腺類器官在幾分鐘內成功轉移到晶元上並培養了 10 天，同時在使用 6 個 FCB 的多重灌注實驗中保持其結構和功能，驗證了該系統是乙個靈活且易於使用的平台，可將類器官與先進的微流體技術緊密整合。
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研究方法： methods
本文的研究方法主要基於：模組化微流控系統，使用類似於樂高積木構建微流控晶元，實現類器官的培養和研究。
具體來說，研究人員首先設計和製造了不同型別的模組化元件，包括細胞培養室、微流體通道、閥門和幫浦。 然後，這些元件可以以簡單的方式組裝，以構建不同的微流控晶元，以適應不同型別的類器官和實驗需求。 FCB 是通過在聚碳酸酯 （PC） 板上銑削乙個通道，然後用另一塊 PC 板熱壓而形成的。 類似樂高的流體聯結器允許在各種細胞培養磚和 FCB 之間實現即插即用連線。 鎖定和播放 （LNP） 夾子整合到類器官塊中，以方便（解除安裝）載入類器官。
在製造出微流控晶元後，研究人員使用這些晶元來生長和研究不同型別的類器官，包括肝臟、肺、腎臟和甲狀腺等。 在培養過程中，研究人員可以使用微流控系統來控制細胞的生長環境，包括溫度、氧氣濃度、營養物質和藥物。 此外，微流控系統可用於收集和分析細胞培養基中的代謝物和分泌物，以評估類器官的功能和反應。
除了使用微流控系統培養和研究類器官外，研究人員還使用了多種分析方法來評估微流控晶元的效能和類器官的功能。 這些方法包括細胞活力分析、免疫染色和共聚焦顯微鏡成像。 通過這些方法，研究人員可以評估微流控晶元的可行性和效率，並確定其在類器官研究中的應用潛力。
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主要結果。 results
1. 設計
微流控系統由乙個無管流體電路板組成，該電路板可以通過新型流體互連連線到類似樂高的細胞培養模組塊。 電路板尺寸為39x137mm，由兩層PC組成，頂層為流體介面，底層為微流體通道。 這些通道通過熱壓接閉合。 該系統允許細胞培養基質在模組的磚塊之間迴圈，形成乙個單一的微流控平台。 模組磚的通用尺寸為38x38mm，高度因功能而異，從15-30mm不等。 不同微流控通道布局的底板可以粘接在頂板上，這樣模組磚可以多種方式配置，增加系統的通用性。 有兩個示例系統，乙個由帶有OOC磚和罐磚的流體電路板組成，另乙個由兩個帶有OOC磚的罐磚組合成乙個單獨的流體室。 所有板均通過標準魯爾型 I-O 埠連線到外部幫浦，最多可併聯安裝 6 個用於細胞培養，總容量約為 1 個3公升。 所有組分均可滅菌並重複用於多種培養實驗。
圖1 這是乙個用於動態培養類器官模型的模組化微流控平台。 （A）FCB和細胞培養磚的3D設計概念。 在FCB中即插即用地插入積木是通過樂高啟發的流體聯結器實現的。 （b） FCB由頂層PC層（具有流體介面）與底層熱粘合，底層刻有通道。 底層可以根據需要進行定製，以建立不同的流體通路。 （c） 不同底部FCB層中不同流體路徑的示意圖。 FCB** 帶有儲液罐和 OOC 磚，** 注入紅色和藍色食用色素。 多孔膜載體可以整合在OOC裝置中，用於各種研究，例如跨生物屏障的跨上皮轉運和細胞遷移測定，以及生物活性因子梯度的研究。 （D） 和 （e） 細胞培養實驗前後的 6 個 FCB**。
2. 製作 FCB
本研究中FCB（流體電路板）的製造涉及多個步驟。 首先，使用 SOLIDWORKS 軟體對 FCB 設計進行建模，並使用 VisualCAM 軟體將其轉換為 G 程式碼檔案。 然後使用CNC銑床製造FCB，從而可以快速準確地加工具有不同槽形的PC板。 底部 FCB 層加工成各種槽槽幾何形狀和尺寸，從 03 比 10公釐。 FCB的頂層由帶有流體介面的PC層組成。 加工成功後，通過液壓機將底部的FCB板與上部的FCB板一起熱壓在一起，並由聚合物膠膜介導。 優化鍵合溫度，避免通道變形和洩漏。 最後，將粘合的FCB板灌注螢光素染料以測試洩漏。 FCB製造工藝經過優化，可實現可靠、無洩漏的微流體通道密封。
圖2 微銑流體通道和PC-PC FCB板的熱壓粘接。 （a） ** 具有劃線流體路徑的 PC 試樣（寬度 = 1 mm，高度 = 0.）。5mm）。右側是具有不同幾何形狀（圓形、正方形和三角形）的通道橫截面的光學雷射影象。 比例尺，500μm。 （b） 劃定通道的地形分析。 劃線通道的大小由光學輪廓儀（Keyence VK-X100K）量化。 （c） 在不同的主軸轉速和進給率下銑削測試槽時，表面粗糙度 （RA） 的量化（平均標準偏差）。 資料來自三個銑削副本 （n=3），每個點表示樣品表面積上多條線 RA 測量值的平均值。 （d） 確定微通道的範圍和毛刺形成的光學**。 影象以 10 倍放大倍率拍攝。 比例尺，250μm。 （e） 用於粘接兩塊FCB板的系統裝置（鋁，鋁）示意圖。 f） 用螢光素染料灌注並在不同鍵合溫度下預鍵合的閉合通道的螢光影象。每個鍵合溫度下的螢光強度（au.，任意單位）如下。對於每個影象，繪製三條垂直於通道長度的線並等距。 （g） FCB樣品**的封閉通道。 i） 在 120 °C 和 140 °C 下粘合的兩個通道橫截面的體視顯微鏡影象。 比例尺，500μm。 （j） 在不同粘接溫度下粘接的通道高度和寬度的變化。 所有資料均採用Kruskal-Wallis檢驗具有統計學意義。 ns， 非顯著性; p>0.5；*p<0.1；**p<0.01。資料來自兩個獨立的粘合劑樣品（n=12）的四個通道橫截面的三次測量。
3.即插即用流體互聯
在模組化微流控平台上，通過使用FCB的圓形凹槽（孔）和類似於樂高積木的底部（塞子）來實現即插即用的流體互連。 插頭和凹槽同軸對齊，並具有輸入輸出 （I-O） 孔，允許液體在模組化磚和 FCB 之間流動。 I-O 埠的尺寸和幾何形狀是可調節的，以確保毛細管力在與 FCB 斷開後將液體保持在模組化磚內。 此外，在每個安裝O形圈的塞子中都建立了乙個徑向凹槽，以便在與FCB凹槽壁接觸時形成密封。 O型圈槽是預潤滑的，槽的角是倒角的，以避免損壞密封件。 確定適當的間隙和 O 形圈壓縮對於在模組化磚和 FCB 之間建立可靠且可逆的密封至關重要，從而實現系統的快速組裝和拆卸。 即插即用的流體互連旨在在模組化磚和 FCB 之間提供簡單且可逆的連線，便於系統的快速組裝和拆卸。
圖3 樂高式流體介面的發展。 （a） ** 包含四個螺栓的模組化磚的底部。 螺栓彼此之間等距，類似於市售樂高積木的螺栓。 （b） 流體介面的3D模型。 將模組化磚插入 FCB 的圓形凹槽中。 O形圈徑向放置在螺栓上。 通過集中和對齊的微通道，實現了模組化磚和FCB之間的流體連線。 （c） O型圈失效情況圖示。 高間隙和低壓縮會導致洩漏，而過度壓縮會導致 O 形圈被夾住和損壞。 （d） 最大爆破壓力值的量化，因為螺栓是由3D列印樹脂（MED610TM）或機加工的PC（平均S.）製成的。e.m） 密封強度的量度。（e） 將模組化磚插入 FCB 中，並在 05ml min-1 速率灌注**。 f） 由 3D 列印材料和機加工 PC 製成的 O 形圈螺栓成功插入的百分比。（g） 3D列印和加工的PC螺栓的側壁和O形圈槽，帶和不帶O形圈**。 比例尺，15mm。（h） 用於PC螺栓3D列印和加工的O形圈凹槽表面的3D熱圖。 （j） 3D列印和機加工螺栓表面精度的測量（平均s.）e.m）。
4. 模組模組和LNP OOC
模組化磚塊和LNP（鎖定-**OOC（器官晶元））是模組化微流控平台的關鍵元件。 模組模組設計用於執行各種功能，包括細胞培養基罐、pH 和氧感測器模組以及可逆封裝的 OOC。 這些磚具有相同的外部尺寸和四螺釘聯結器布局，便於與 FCB 連線。 所有模組化磚的流體通道都由一組由 PDMS 鑄件製成的特定流體層定義，這允許在多個滅菌週期後保持透明度、易於清潔和厚度保持。
LNP 夾子被提議用作緊韌體，以促進類器官快速輕鬆地載入和解除安裝到微流控 OOC 中。 這種方法結合了新型無內胎 FCB 和帶有可逆 LNP 密封件的 OOC 模組磚，可直接進入電池室。 FCB 允許通過樂高式流體介面將各種細胞培養磚直接連線到 FCB，無需管路和側面韌體，而 LNP 密封有助於在 OOC 磚中培養類器官。 這種協作方法減少了手動組裝操作的時間和複雜性，最終促進了功能類器官在晶元上的整合。 該平台已通過在晶元上保護甲狀腺類器官的結構和功能進行了驗證，展示了其在高階類器官應用方面的潛力。
圖4 細胞培養模組模組和LNP晶元裝置的開發。 （a） 器官晶元、細胞培養基罐模組、用於連續測量溶解氧和 pH 值的感測器模組以及小型顯微鏡的 3D 模型檢視。 （b） LNP器官晶元裝置的3D**模型檢視。 該器件由乙個 PC 外殼（灰色）、乙個流體晶元（青色）和乙個熱成型薄膜載體（黃色）組成。 載體可以用鑷子輕鬆移入和移出晶元。 用 4 倍放大倍率拍攝的明場**顯示了在膜載體中培養的 MatrigelTM 包埋的小鼠 ESC 衍生的甲狀腺類器官。 比例尺，250μm。 （c） 夾緊和未夾緊的器官晶元**。 d） 器官晶元器件流體路徑的 3D 檢視。（e） 從LNP晶元器官裝置的被動氣泡捕獲盒的延時記錄中提取的靜止影象。 裝置以 0 開頭以5ml min-1的速率灌注藍色食用色素。
5. FCB平台用於類器官培養的驗證
FCB平台已通過類器官培養驗證，特別是MatrigelTM包埋的甲狀腺類器官。 該平台允許這些類器官在靜態條件下在微熱成型載體中預成型和培養三天。 該驗證證明了FCB平台適用於類器官培養，解決了以前與晶元類器官培養相關的挑戰。 該平台的設計，包括使用模組磚和LNP夾子，促進了類器官在微流體環境中的培養，降低了手動組裝操作的複雜性，並使功能類器官能夠整合在晶元上。 驗證還證實了晶元上甲狀腺類器官的結構和功能的保留。
圖5 為類器官培養開發的微流控平台的驗證。 （a） 實驗裝置**，第 0 天。 FCBS 與 6 個儲液罐、6 個 OOC 模組模組和 1 個感測器模組模組模組連線，用於監測 DO2 和 pH 值。 （b） 第 3 天灌注時大多數 OOC 模組磚的俯檢視。 一些氣泡被困在氣泡陷阱中。 （c） 第10天的側檢視。 **流體介面處無洩漏。 （d） 感測器模組磚的底檢視。 黃色箭頭表示流經氣泡阱、pH感測器點（白色）和最後通過黑點（DO2）的方向。 （e） 連續測量氧氣和pH值。 （f） 在流動或靜態孔中暴露於 3 天和 10 天的甲狀腺類器官培養物。 綠色是由TG啟動子驅動的GFP。 明場影象以 4 倍放大倍率拍攝。 比例尺，150μm。 在具有靜態對照的 OOC 模組磚中培養的類器官的活死染色螢光影象。 紅色是用乙錠同源二聚體-1 （ethD） 染色的死細胞。 比例尺，250μm。 （g） 甲狀腺類器官的等效直徑測量值。 所有資料均表示為平均值 （n=35），並使用 Kruskal-Wallis 檢驗進行統計學顯著性檢驗。 ns， 非顯著性; p>0.05。（H） 在 OOC 模組磚中培養 3 天的甲狀腺類器官的共聚焦 Z 投影。 用GFP（綠色）標記、TG（紅色）、ZO-1（白色）染色和DAPI（藍色）復染的類器官的免疫螢光影象。 影象以 25 倍放大倍率拍攝。 比例尺，100 μm和插圖，25 μm。
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總結。 suggestion
本研究描述了用於 3D 類器官培養的模組化微流控平台的開發。 該平台由無管流體電路板 （FCB） 和可逆封裝的細胞培養塊組成，包括器官晶元 （OOCS） 和感測器模組。 FCB是通過在聚碳酸酯（PC）板材中銑削乙個通道，然後用另一塊PC板熱壓而成的。 樂高式流體聯結器允許在細胞培養積木和 FCB 之間實現即插即用連線。 LNP 夾子整合到 OOC 塊中，以方便類器官的載入和解除安裝。 該平台已通過MatrigelTM包埋甲狀腺類器官的培養驗證，證明了其適用於類器官培養，並有可能應用於先進的類器官應用。 平台的模組化設計和不同模組之間使用相同的流體介面有助於新元件的設計過程，使其適用於FCB。 該平台的設計降低了手動組裝操作的複雜性，最終促進了功能類器官與晶元的整合。 因此，本研究為下一代微生理系統的開發提供了創新和有價值的解決方案。
引用。 a modular microfluidic organoid platform using lego® -like bricks.adv healthc mater. 2024 jan 21:e2303444. doi: 10.1002/adhm.202303444.pmid: 38247306.
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