本文**： 類器官協會
敬請期待更多精彩內容
癌症是一種嚴重的疾病，對人類健康構成巨大威脅。 為了更好地研究癌症的發生和發展，科學家們一直在尋找新的方法和技術。 最近，一項新的研究引起了人們的關注，研究人員通過使用腺嘌呤和胞嘧啶鹼基編輯器（ABE和CBE）啟用類器官中的癌基因，成功地模擬了多種癌症中常見的基因突變。 該技術的應用可為疾病建模和藥敏試驗提供有價值的工具，為癌症**和藥物開發提供新思路。 這項研究來自類器官之父Hans Clevers 團隊
接下來，小學社團將介紹這項新技術的原理和應用，希望能給大家帶來新的啟示。
文章介紹
題目：通過多鹼基編輯技術在成體幹細胞衍生的類器官中一步生成腫瘤模型。
發表期刊： Nature Communications
指標因子：if=166009
發布時間：2023 年 8 月。
#
背景： background
成體幹細胞衍生的類器官是一種重要的研究工具，可以彌合 2D 細胞系和體內動物模型之間的差距，用於研究人體組織的健康和疾病。 腫瘤模型的構建對腫瘤學研究具有重要意義，可以從活檢和手術切除組織建立患者來源的腫瘤樣本庫，作為模型在體外模擬腫瘤發生，為患者提供個性化的可能性。
以往的基因組工程方法在構建人類癌症模型方面面臨一些挑戰。 本研究旨在開發一種高效的一步策略，通過基因編輯器在成體幹細胞衍生的類器官中建立單鹼基變異的複雜組合，以模擬人類腫瘤的遺傳特徵。 通過將功能選擇與這種方法相結合，可以有效地建立具有複雜基因型的突變類器官庫，並通過Sanger測序驗證其準確性。 此外，這項研究證明了多重CRISPR基因編輯的靈活性和多樣性，以模擬多種上皮組織中的腫瘤發生。 該方法有望廣泛應用於體外腫瘤模型的構建。
#
研究思路。 methods
使用 ABE 和 CBE 模擬肝細胞類器官中的 CTNNB1 熱點突變。
使用 C>T 鹼基編輯器在子宮內膜類器官中插入 PTEN 的突變表明，即使在雜合狀態下也可以引起腫瘤形成。
對PTEN或具有PTEN和PIK3CA突變的類器官進行藥敏試驗，以了解子宮內膜腫瘤發生的初始階段。
結合 SPCAS9 和 SACAS9 在單個靶位點同時進行 C>T 和 A>G 編輯，建立結直腸腫瘤發生模型。
#
發現： results
1.ABE和CBE適用於類器官中的癌基因啟用
在多種癌症型別中觀察到 WNT 通路的突變啟用，特別是涉及 WNT 效應基因連環蛋白 （CTNNB1） 中的特定點突變。 以前的研究人員已經使用CBE突變體S45殘基模擬了磷酸化級聯反應的第一步，並且模擬隨後的磷酸化缺陷需要一種不依賴於傳統Cas9蛋白的方法。 本文通過探索識別非典型 PAM 的 SPCAS9-ABE 變體來解決這個問題。 研究人員設計了三種單嚮導RNA（sgRNA），在CTNNB1的外顯子3中引入四個獨特的突變。
該研究使用基於轉座子的整合方法引入抗生素抗性基因，以實現類器官轉染的有效選擇。 他們通過在腫瘤抑制基因TP53中引入W53*突變來驗證這種方法，並發現Nutlin-3和潮黴素的選擇允許對TP53突變體和TP53W53*突變類器官進行功能篩選。 結果表明，抗潮黴素系統可以增加培養物中突變類器官的百分比，並量化與CRISPR技術相關的編輯效率。
研究人員還設計了sgRNA來誘導CTNNB1突變，以防止E3連線酶依賴性降解。 這些 sgRNA 可以靶向磷酸化位點（T45、T41 和 S33）以及螢光粉降解位點 （D32）。 通過用穩定整合土黴素盒的 sgRNA 和質粒轉染 ABE 或 CBE 來評估 ABE 和 CBE 的編輯效率。
研究人員對 CTNNB1 進行了免疫組織化學標記，並使用共聚焦顯微鏡評估其在轉殖野生型和突變類器官單細胞中的細胞內定位，發現攜帶 CTNNB1 突變的類器官在細胞核內的表達增加，表明 -catenin 易位到細胞核以啟用下游靶基因。 這些資料成功地證明了ABE和CBE在肝細胞類器官中癌基因啟用的應用（圖1）。
圖12.使用 ABE 和 CBE，可以研究單個熱點突變的致瘤潛力
比較CTNNB1蛋白在突變型類器官和野生型類器官中的細胞內定位和分布，並進行基因表達和功能分析。 S45p 和 D32G 突變導致細胞核中連環蛋白的表達增加，並導致 Wnt 訊號轉導的啟用率增加。 S45P突變後，較高比例的活化連環蛋白可以轉運到細胞核中，而D32G突變後仍有很大一部分被隔離在膜上。 此外，突變類器官能夠在沒有通路啟用劑的情況下繼續生長，RNA測序和qPCR結果顯示，Wnt通路的靶基因上調，表明細胞自主啟用了Wnt通路。 此外，突變導致與癌症發病和進展相關的特定基因的上調。 因此，CTNNB1 第三個外顯子中的熱點突變可導致 Wnt 訊號通路的顯著啟用，而 Cas9 的傳統和進化形式可以通過 ABE 和 CBE 在人 ASC 衍生的類器官中引入點突變（圖 2）。
圖23.CBE介導的CRISPR-STOP可用於模擬類器官中子宮內膜類器官的腫瘤發生過程
研究人員使用SPCAS9-CBE對PTEN基因進行編輯實驗，試圖引入Q245*的純合突變。 結果顯示，他們設法觀察到20個轉殖中有15個（約75%）的編輯效率。 為了提高編輯效率，研究人員嘗試了另一種編輯器變體SPRY-CBE，該變體成功地在19個轉殖中的3個（約11%）中引入了R130*雜合突變，從而克服了模擬早期子宮內膜腫瘤發生的主要瓶頸。
接下來，研究人員評估了PTEN中Q245*和R130*突變對子宮內膜類器官的影響。 結果表明，這兩個突變並沒有改變類器官的囊性形態。 PTEN突變類器官中Pten蛋白表達下調，MTOR表達增加，突變細胞核磷酸化增加。 這表明，即使是雜合子功能喪失突變也可能導致PTEN PI3K訊號通路的過度啟用。 接下來，研究人員使用相同的鹼基編輯器引入了PIK3Ca的E545K突變，並使用RNA測序分析了雙突變類器官中的基因表達變化，發現與野生型類器官相比，突變類器官中的AKT、mtor、PIK3R3和IGFBP5基因上調。 最後，研究人員對PTEN PI3K通路進行了藥敏試驗，發現PTEN PIK3CA突變降低了類器官對mTOR抑制劑的敏感性，證明了研究人員開發的工具包在生成具有早期腫瘤發生新突變的等位基因模型方面的顯著優勢（圖C-D）。
圖34.CBE多重技術可同時啟用癌基因和腫瘤抑制基因滅活
研究人員利用CRISPR基因編輯系統成功構建了含有癌基因和抑癌基因突變的類器官系，並通過實驗驗證了這些突變的綜合療效。
研究人員為APC和TP53基因設計了兩個sgRNA，並成功引入了預期的突變（APCQ1406*和APCR1114*、TP53R213*和TP53W53*），並通過Sanger測序進行了驗證。 接下來，他們將 APCQ1406* 和 TP53W53* 與 PCMV-ANCBE4Max-P2A-GFP 共轉染，並通過去除 WNT-3A rspondin-1 並新增 Nutlin-3 來選擇類器官。
研究人員成功地重建了腸道類器官中PIK3CAE545K致癌突變，並將其與PCMV-ANCBE4MAX、APCQ1406*和TP53W53*sgRNA共轉染。 Sanger測序發現突變引入率為100%。 APC（WNT 去除）和 TP53（新增 Nutlin-3）的突變評估以及 PIK3CAE545K突變的基因分型發現總編輯效率為 875%（圖B）。
圖45.Cas9 同源物多重檢測允許在不同的靶位點同時進行 CBE 和 ABE 檢測
CAS9 CBE和ABE單獨用於引入致癌啟用抑癌基因失活突變，但其聯合在腫瘤建模中的應用尚未得到廣泛探索。 這裡的挑戰在於，c>t引發的抑癌基因滅活sgRNA也可以被spcas9-abe用於在同一位置引入a>g突變，反之亦然，而且並非所有致癌啟用突變都是c>t，因此單獨使用CBE可以實現多個突變。 為了規避這個問題並擴充套件鹼基編輯器的靈活性，研究人員瞄準了更廣泛的PAM，並使用了具有不同sgRNA骨架的Cas9同源物。 他們假設 SAKKH-CBE 的多重技術與 SPCAS9-ABE 相結合，可以同時進行 A>G 和 C>T 編輯，而不會受到任何靶位點的 sgRNA 干擾。
研究團隊設計了六個sgRNA，將早期終止密碼子引入tp53基因。 轉染後，他們觀察到SAKKH-CBE對肝細胞器官中TP53突變的選擇性編輯，其中大多數嘗試實現了正確的C>T突變，一些轉染的轉殖表現出意想不到的基因編輯結果。 然後用sgRNA共轉染兩個鹼基編輯器，成功發現sgRNA，並高效編輯靶向TP53和CTNNB1突變的類器官。
隨後，利用sgRNA共轉染SAKKH-CBE和SPCAS9-ABE，在肝細胞類器官中成功實現TP53和CTNNB1突變。 最後，他們通過多次精準操作，成功編輯了APC和TP53基因，在結腸類器官中引入了PIK3CAH1047R突變。 這些結果表明，SAKKH-CBE可以有效地在人ASC**的類器官中引入終止密碼子。 此外，雖然使用 SAKKH-CBE 可以觀察到 C>T 以外的編輯結果，但高編輯效率確保使用 Sanger 測序輕鬆篩選包含所需和靶向突變的類器官（圖 4D、5）。
圖56.一步生成包含突變體的微型生物樣本庫，可複製完整的結直腸癌腫瘤發生
在先前證明類器官鹼基編輯的效率和多功能性的實驗的基礎上，該研究的目標是通過單個電穿孔反應模擬惡性轉化的全部複雜性。 採用野生型結腸類器官共轉染模擬結直腸癌突變過程，篩選出96個轉殖進行基因分型，共觀察到APC單突變體4個、雙突變體24個、三重突變體46個、四突變體22個。 這表明 SMAD4 和 TP53 突變的加入使類器官在明場影象上具有越來越密集和複雜的表型。
設計了一種與識別 NGT PAM 的 Cas9-CBE 變體一起工作的 sgRNA，以在 KRAS 中引入第 12 個氨基酸突變，並測試其功效。 結果表明，選擇的32個轉殖均存在APC同源突變，28個轉殖存在氨基酸12突變，在KRAS G12上觀察到2個不同的突變。 對其他位點的進一步基因分型顯示突變頻率與之前的四重實驗相似。 這些資料表明，進化的 CAS9 變體可用於擴大類器官腫瘤建模的靶點範圍。 通過使用這些識別替代 PAM 基序的 Cas9 變體，可以建立基因型反映腫瘤發生不同階段的類器官模型（圖 6）。
圖67.鹼基編輯在腫瘤建模中的安全性和應用範圍
採用全基因組測序分析多重檢測對結腸類器官的潛在脫靶效應。 研究發現，在體細胞突變負荷中，在多個轉殖中觀察到的突變數量相對較少，並且序貫突變腫瘤的體細胞突變負荷增加34 倍，序貫轉殖突變載量增加 55 倍，兩種策略之間突變負荷的主要差異是由於轉殖擴增和體外培養而不是鹼基編輯。 此外，sgRNA依賴性脫靶效應非常罕見。 研究發現，多重技術與CBE和ABE相結合可能對單個SNV的功能特徵以及癌基因和抑癌基因的突變產生重大影響，這表明在類器官中建立腫瘤模型時，多重技術是一種相對安全的策略。 此外，通過使用多重技術，轉殖類器官系中引入的突變比序貫引入的突變更少（圖7）。
圖7總結
在這裡，我們描述了一種使用 ABE 和 CBE 啟用類器官中癌基因的新技術。 該技術可以模擬各種癌症中常見的基因突變，例如CTNNB1基因中的熱點突變。 研究人員使用這些編輯酶成功啟用了該基因，並觀察到相關的細胞學和分子變化。 此外，研究人員使用這種技術來模擬其他癌症相關基因的突變，並通過藥敏實驗驗證了這些模型的可靠性。 該技術的應用可為疾病建模和藥敏試驗提供有價值的工具。 綜上所述，這項研究為我們提供了一種新的癌症研究方法，並有望為癌症**和藥物開發提供新的思路。 因此，該技術的發展對癌症研究和**具有重要意義。
引用。 geurts mh, gandhi s, boretto mg, akkerman n, derks llm, van son g, celotti m, harshuk-shabso s, peci f, begthel h, hendriks d, schürmann p, andersson-rolf a, chuva de sousa lopes sm, van es jh, van boxtel r, clevers h. one-step generation of tumor models by base editor multiplexing in adult stem cell-derived organoids. nat commun. 2023 aug 17;14(1):4998. doi: 10.1038/s41467-023-40701-3. pmid: 37591832; pmcid: pmc10435570.
過去推薦
nature materials |大家必讀的高分評論！揭開腫瘤類器官的現狀，結合中藥和類器官技術，發現甘草的偉大用途！【自然實驗方案】系列：基於類器官技術，學習誘導多能幹細胞通過120個步驟產生胚狀重量2024年，共有87個國家天然類器官專案，資助金額超過3000萬（名單附後）。本文**： 類器官協會
敬請期待更多精彩內容