**推薦
Expi293F 表達用於螢光內毒素檢測的重組鱟試劑因子 C
作者：
柯文峰1,2,3， 李世傑1,2,3， 鄭夢林1,2,3， 白忠虎1,2,3， 楊彥坤1,2,3
單位：
1 江南大學工業生物技術教育部重點實驗室。
2 江南大學國家糧食發酵與食品生物製造工程技術研究中心。
3 江蘇省生物活性製品加工工程技術研究中心。
**專案：
國家重點研發計畫（2018YFA0900804）; 國家輕工業技術與工程一類學科自主專案（lite2018-24）。
摘要>關鍵詞
總結：馬蹄蟹C因子是一種絲氨酸蛋白酶，對微量內毒素高度敏感，可作為LAL的替代品，用於製藥行業的內毒素檢測。 然而，其重組表達困難，需要高度控制環境中的內毒素。 本文從東方鱟中轉殖了**的全長C因子，在N端和C端分別加入Flag標籤和6個His標籤，將原有的C因子訊號肽替換為哺乳動物細胞表達載體中分泌的訊號肽。 將重組質粒轉染人胚胎腎細胞Expi293F懸浮培養物7 d，收穫上清液，Western blot檢測出的蛋白符合**大小128 kDa，具有與內毒素結合的能力，結合後可裂解螢光底物。 本研究首次在人胚胎腎細胞Expi293F中成功表達具有生物活性的全長因子C，表達水平達到1918 mg L，比昆蟲細胞SF9中DING的表達量高113%。 該方法對後續低成本內毒素檢測試劑盒的開發具有指導意義。
關鍵字：內毒素檢測; 馬蹄蟹C因子; expi293f；重組表達; 脂質轉染。
主要結論：
為構建有效的重組因子C（RFC）表達體系，本研究轉殖了三齒速蚤中因子C的全基因序列，並首次在人胚胎腎細胞Expi293F中進行重組表達。 經檢測，RFC可溶於細胞外分泌，大小與**一致，初始純度為48%，鎳柱純化後的RFC純度達到98%，收率為56%，與SF9細胞相比，蛋白表達（1981 mg l）增加了113%，大大降低了表達成本。它具有與內毒素結合並裂解螢光底物的生物活性。 該表達系統將為重組檢測的開發提供新的途徑，並有助於內毒素檢測。
a-pcdna3.4-RFC質粒雙消化瓊脂糖凝膠電泳分析; b-pcdna3.4-RFC向量圖。
圖1 RFC基因的轉殖及載體構建。
fig.1 cloning and vector construction of rfc
細胞培養上清液的A-Western印跡測定（Flag標籤）; B細胞培養上清液的蛋白質印跡法（His標籤）
圖2 Expi293F細胞中RFCs的蛋白質印跡檢測。
fig.2 western blot detection of rfc expression in expi293f cells
注：M：蛋白質標準分子量標記物; 1：非還原上樣緩衝液處理的細胞培養上清液; 2：用還原上樣緩衝液處理的細胞培養上清液; 3：非還原上樣緩衝液處理的細胞培養上清液; 4：用還原上樣緩衝液處理的細胞培養上清液。
A細胞培養上清液的SDS-PAGE測定; 純化後的B-SDS-PAGE檢測。
圖3 RFCs的表達和純化。
fig.3 expression and purification of rfc
注：M：蛋白質標準分子量標記物; 1：非還原上樣緩衝液處理的細胞培養上清液; 2：純化RFC的非還原上樣緩衝液處理
圖4 RFC結合內毒素裂解螢光底物。
fig.4 rfc combined with endotoxin to cut fluorescent substrate
注：* 表示顯著差異 （p < 0.）。05）。
在此之前，本團隊還重組表達了東方馬蹄蟹的C因子**在大腸桿菌BL21（DE3）、畢赤酵母GS115和谷氨酸棒狀桿菌BZH001中，但遺憾的是，LAL的C因子在大腸桿菌、畢赤酵母和谷氨酸棒狀桿菌中沒有表達，推測鱟劑C因子是一種具有雙鏈結構和多個醣基化位點的大分子蛋白， 所以它不能在原核生物和低等真核生物中表達。本研究首次在人胚胎腎細胞EXPI293F中成功重組表達RFCs，與蛋白質結構模型一致，具有與內毒素結合和裂解螢光底物的生物活性，其裂解螢光底物的能力高於LOZA試劑盒中的RFC。 與昆蟲細胞SF9中DING的表達水平（9 mg L）相比，該表達系統的蛋白表達（1981 mg L）增加了113%。該方法對後續低成本RFC重組表達系統和內毒素檢測試劑盒的開發具有重要的指導意義。
認識團隊。 
近年來，江南大學白忠虎教授團隊專注於合成生物學、生物醫藥和生物反應器領域的研究，並取得了豐碩的成果，相關研究成果發表在Nature Catalysis（2023）、Biotechnology and Bioengineering（2023）、ACS Synthetic Biology等該領域權威期刊上。
通訊作者
楊彥坤副教授是江蘇省“六大人才峰”候選人。 從事發酵工程、微生物學、分子生物學和合成生物學的研究，主要負責分子生物學、生物化學和高階分子生物學課程的教學。 發表SCI研究論文60餘篇，參與編纂專著3部; 申請發明專利20餘項;主持國家重點研發計畫、863、國家自然科學**等國家級、省部級科研專案8項; 主持企業橫向專案7個; 獲商聯國家科技進步二等獎1項; 他指導學生獲得了3個國家和省級競賽獎項。
引文格式
柯文峰， 李世傑， 鄭夢林， 等. Expi293F重組馬蹄蟹因子C在螢光內毒素檢測中的表達[J].食品與發酵工業， 2024， 50（2）：106-111