帕金森病(parkinson’s disease,pd）是第二常見的神經退行性疾病，在全球老年人群中的患病率為1-2%（>65）。2024年，安德魯·辛格爾頓（Andrew Singleton）的小組和托馬斯·加瑟（Thomas Gasser）的小組通過基因研究首次發現了富含亮氨酸的重複激酶2lrrk2）與帕金森病高度相關，該激酶已成為帕金森病領域的研究熱點之一。值得一提的是，這兩位學者還憑藉這一開創性工作獲得了2024年“學術界奧斯卡”breakthrough prize（基因功能獲得性突變是導致家族性（5%）帕金森病的最常見遺傳因素，也是偶發性（1%）帕金森病的關鍵遺傳危險因素。目前，LRRK2基因已鑑定出250多個突變，生化研究表明，一些致病突變體表現出激酶活性顯著增強（如最常見的致病突變體LRRK2G2019S）。。因此，LRRK2已成為該病的潛在藥物靶點，其抑制劑的研發引起了研究人員的廣泛興趣值得一提的是，LRRK2特異性I型抑制劑DNL201和DNL151在臨床試驗中取得了良好的進展
LRRK2 蛋白廣泛表達於腦、心臟、腎臟和肺等器官和組織。 它參與體內多種細胞生理過程，包括自噬、神經突增殖調節、突觸形態發生、膜運輸、蛋白質合成和一些線粒體疾病。LRRK2蛋白全長含有2527個氨基酸殘基，由7個結構域組成，具有激酶和GTP水解酶活性，其內部結構域之間的組裝和相互調控很複雜。 研究表明，LRRK2蛋白在細胞中以多種聚集形式存在，包括單體、二聚體和寡聚體，LRRK2蛋白在不同聚集狀態下的活性也不同。 一些LRRK2致病突變體可以在微管表面形成細絲結構，從而影響微管相關的生理過程。 LRRK2 可被反式高爾基體網路附近的細胞內過表達的 Rab29 募集和啟用，從而增強其自磷酸化和磷酸化 Rab 底物活性，調控下游生理功能。然而，LRRK2啟用的分子機制和抑制劑結合對LRRK2蛋白構象的調控尚不清楚。
2024年12月22日，美國聖裘德兒童研究醫院孫驥英國鄧迪大學生命科學學院研究組dario r. alessi課題組合作science該雜誌發表了一篇題為rab29-dependent asymmetrical activation of leucine-rich repeat kinase 2研究**。 作品首次報道了人LRRK2和Rab29蛋白複合物的不同聚集狀態（單體、二聚體和四聚體）以及LRRK2蛋白結合抑制劑DNL201的冷凍電鏡結構，揭示了LRRK2被Rab29募集和啟用的分子機制（圖 1）。
在前期的工作中，孫驥團隊率先報道了一系列高分辨的人類全長LRRK2冷凍電鏡結構，解析的LRRK2結構均處於開放非活性構象狀態目前，活化的LRRK2結構僅限於低解像度的微管結合或I型抑制劑結合的LRRK2結構。 為了捕獲活化態LRRK2的高解像度3D結構，作者首先在體外重構了RAB29-LRRK2複合物，並成功解析了其包含三種聚集態（單體、二聚體和四聚體）的高解像度結構。 結構顯示 Rab29GTP 與 LRRK2 蛋白的 N 端 ARM 結構域結合。 通過對結構、生化酶活性和雷射共聚焦成像的分析，揭示了介導Rab29募集和啟用LRRK2的相互作用介面和關鍵氨基酸殘基。 在單體和二聚體構象中，LRRK2表現出開放失活狀態。 令人驚訝的是，在Rab29-LRRK2複合物的四聚體構象中，作者不僅觀察到處於開放非活性狀態的外周LRRK2分子（LRRK2peri），還觀察到處於封閉狀態的中間LRRK2分子（LRRK2cent）。（圖 1）。。LRRK2CENT表現出啟用劑狀態激酶的一系列典型特徵，包括“dyg-in”、穩定的活性環、向內的交流螺旋和空間連續的 R 脊柱。 此外，LRRK2CENT可以完美地擬合已報道的LRRK2結合微管的冷凍電子斷層掃瞄電子密度模式。 基於此，可以推斷出四聚體中的lrrk2cent處於封閉的活性構象中。 由於LRRK2啟用過程中的構象變化，LRRK2cent KIN結構域的一些關鍵二級結構元件直接與COR結構域相互作用（圖 1）。以進一步穩定構象。 突變體分析表明，這種相互作用對於維持LRRK2激酶活性至關重要。
（圖 1）。LRRK2 啟用期間的構象變化。
在本文中，我們進一步提出了Rab29介導的LRRK2膜定位和不對稱啟用的潛在分子機制模型（圖 1b）。：1）膜定位的Rab29GTP首先募集LRRK2形成無活性單體和二聚體，隨著區域性LRRK2分子濃度的增加，形成含有活化態的四聚體。2）LRRK2（四聚體形成）活化過程中，LRRK2CENT發生較大的構象變化，其C端kin-WD40結構域靠近COR結構域，直接相互作用，產生穩定的封閉活化構象。3）自我抑制的LrRK2cent N-末端結構域（arm-ank-lrr）在啟用過程中被釋放，由於其靈活的構象而無法觀察到。4）LRRK2CENT的N端結構域的釋放導致Kin結構域的暴露，可有效對膜定位的Rab底物發揮激酶活性。此外，lrrk2cent的活化狀態為一些致病突變體的工作機制提供了很好的結構解釋。
LRRK2特異性I型抑制劑的結合可以誘導LRRK2的封閉活性樣構象的形成。 為了進一步驗證LRRK2CENT確實處於閉合活化狀態，並研究LRRK2的藥理學，作者解析了LRRK2與I型抑制劑DNL201聯合的冷凍電鏡結構。 結構對比表明，LRRK2結合DNL201的構象與LRRK2CENT相似，再次證實了LRRK2CENT的主動構象推斷。 最後，作者比較分析了Rab29及其同源蛋白RAB32和Rab38對LRRK2的啟用作用。 雖然三者均能膜定位並啟用LRRK2對Rab10的磷酸化活性，但只有Rab29的結合才能促進LRRK2四聚體的形成，增強LRRK2 Ser1292位點的自磷酸化水平（圖 2）。LRRK2突變攜帶者的尿外泌體中LRRK2 Ser1292自磷酸化水平顯著公升高，表明Rab29介導的LRRK2四聚體形成與Ser1292自磷酸化之間存在潛在的病理關聯。 綜上所述，本研究提出了小G蛋白介導的激酶不對稱啟用的新分子機制，為LRRK2抑制劑治療帕金森病的開發和修飾提供了結構基礎**。
（圖 2）。Rab29 募集和啟用 LRRK2 的潛在分子機制模型。
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聖裘德兒童研究醫院孫驥研究員為該文章的通訊作者。 聖裘德兒童研究醫院博士後Hanwen Zhu和英國鄧迪大學生命科學學院Dario Alessi研究小組的Francesca Tonelli博士是本文的共同第一作者。 此外，美國聖裘德兒童研究醫院冷凍電鏡中心工作人員Martin Turk博士和英國鄧迪大學生命科學學院的Alan Prescott博士也為這項工作做出了重要貢獻。
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