作者丨雪嶽CRISPR篩選是發現基因功能的強大工具。 對同一基因的不同等位基因的研究可以為蛋白質結構和功能機制提供獨特的見解。 鹼基編輯技術是一種基於CRISPR的技術，在嚮導sgRNA中引入特異性突變，無需雙鏈斷裂或同源修復，適用於等位基因功能的大規模篩選，並可實現單核苷酸分離。 T細胞是免疫的重要靶點，但免疫有很大的侷限性，很多患者對它沒有反應，因此迫切需要新的方法來分析關鍵基因中的特定核苷酸序列，發現新的功能基因。 鹼基編輯已用於 T 細胞的多次敲除，降低染色體易位的風險，並已應用於 CAR T 細胞產品。 使用高通量突變篩選平台可以揭示 T 細胞等位基因譜，可用於發現更多靶基因以提高免疫力**。 近日，來自加州大學三藩市分校alexander marson團隊在nature發表於題為base-editing mutagenesis maps alleles to tune human t cell functions品。 研究新開發的鹼基編輯系統用於篩選原代T細胞中等位基因的功能，為免疫提供了新的工具**。 
為了在人原代T細胞中實現鹼基編輯器的高通量使用，作者優化了腺嘌呤鹼基編輯器ABE8E（V106W）（縮寫為ABE）和胞嘧啶鹼基編輯器EVOCDA1-BE4MAX（縮寫為CBE）的慢病毒遞送系統。 總的來說，作者設計了乙個包含117,000個sgRNA的文庫，這些sgRNA分布在與細胞活力相關的385個基因的編碼區中，以識別與細胞活化相關的突變。 作者評估了sgRNA的編輯效率，並將增強細胞活化的sgRNA定義為陽性，將抑制細胞活化反應的sgRNA定義為陰性。 作者從篩選中選擇了功能性sgRNA對應靶標的子集。 分析發現，該系統能夠識別已知與細胞活化相關的突變。 接下來，作者分析了 dgkz、LCP2、PIK3CD、PLCG1 和 V**1 的陽性和陰性 sgRNA，系統篩選了這些 sgRNA，以分析不同等位基因的不同功能。 作者驗證了這些篩選結果，發現 DGKZ、LCP2、PIK3CD、PLCG1 和 V**1 的陽性和陰性 sgRNA 分別促進或抑制細胞毒性功能。 據報道，作者篩選的PIK3CD中兩個等位基因突變的功能是原代T細胞中的免疫致病突變，這進一步證實了作者使用的系統可用於篩選功能等位基因。 作者還評估了篩選的功能資料與已知蛋白質結構之間的關係。 分析發現，PIK3CD中的獲得性功能突變可導致3D口袋結構被具體地組合在一起。 Pik3CD與PI3K的PIK3R1調控亞基共結晶，作者也對其進行了篩選和鑑定。 針對 PIK3R1 位點的鹼基編輯可以增加細胞 TNF、IL2 和 IFN 的產生。 這也表明，鹼基編輯誘變可以提供有關原代人 T 細胞蛋白質結構中關鍵殘基和結構域的資訊，包括蛋白質-蛋白質相互作用位點。 該研究表明，鹼基編輯誘變可以加深對分子功能的理解，促進工程蛋白和RNA的發育，為免疫力的發展提供變革性工具**。 原文鏈結：
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