質譜法的體外磷酸化

在體外磷酸化質譜法中，首先在實驗室條件下對目標蛋白或蛋白質混合物進行磷酸化。 這通常是通過使用激酶和ATP來實現的。 然後對磷酸化的蛋白質樣品進行質譜分析。 質譜儀能夠準確測量蛋白質或肽的質量，並通過檢測磷酸化引起的質量變化來識別磷酸化位點。 具體步驟如下：

圖1磷酸化定量蛋白質組學分析工作流程。

1.製備蛋白質樣品：

首先，您需要準備目標蛋白質的樣品。 這可以是純化的蛋白質或複雜的細胞提取物。 確保適當的蛋白質質量和濃度。

2.磷酸化反應：

在體外磷酸化實驗中，將蛋白質樣品與激酶消化的藥物混合以模擬細胞內磷酸化反應。 通常，磷酸化試劑含有磷酸化底物（通常為 ATP）、激酶和反應緩衝液。

3.反應停止：

經過一段時間的反應後，通常使用某種方法停止磷酸化反應。 停止方法通常包括新增熱凝膠樣品緩衝液或加熱樣品以停止反應。

4.樣品分離：

磷酸化的蛋白質樣品需要分離，通常通過SDS-PAGE電泳，以按分子量分離蛋白質。

5.染裁：

分離的蛋白質在凝膠上染色，然後可以通過裂解從凝膠中提取。 切斷感興趣的蛋白質條帶進行質譜分析。

6.質譜：

提取的蛋白質條帶可以通過質譜分析，通常通過液相色譜與質譜聯用 （LC-MS） 來確定磷酸化位點。 將分析質譜資料以確定哪些賴氨酸殘基被磷酸化。

7.資料解釋：

對獲得的質譜資料進行分析，以確定蛋白質的磷酸化位點和磷酸化水平。 這需要使用相關的分析軟體和資料庫來識別磷酸化位點。

體外磷酸化質譜的主要優點是它可以提供有關蛋白質磷酸化狀態和磷酸化位點的詳細資訊。 通過比較磷酸化和非磷酸化樣品，研究人員可以確定磷酸化事件的特定位點以及這些修飾如何影響蛋白質的功能。